Equine
infecsious anaemia, sebelumnya
dikenal sebagai demam rawa, terbatas pada hewan bangsa kuda (equidae). Ditandai
dengan demam berulang, trombositopenia, anemia, cepat kehilangan berat badan dan
edema di bagian bawah tubuh. Sangat merugikan karena hewan yang sembuh akan
menjadi sumber penyakit.
******
EQUINE INFECTIOUS ANAEMIA
RINGKASAN
Equine
infectious anaemia (EIA) adalah infeksi virus persisten yang menetap pada kuda.
Agen penyebabnya, virus EIA (EIAV) adalah lentivirus dalam keluarga
Retroviridae, subfamilia Orthoretrovirinae. Anggota genus Lentivirus lainnya
termasuk: virus bovine immunodeficiency; virus caprine arthritis encephalitis;
virus feline immunodeficiency; virus human immunodeficiency 1; virus human
immunodeficiency 2; dan virus maedi /visna. EIA dapat didiagnosis berdasarkan
tanda klinis, lesi patologis, serologi dan metode molekuler. Kuda yang
terinfeksi tetap sebagai pembawa penyakit seumur hidup dan, dengan pengecualian
yang sangat jarang, menghasilkan hasil tes serologis positif. Respon antibodi
biasanya bertahan dan hewan yang memiliki antibodi positif, lebih tua dari 6-8
bulan, diidentifikasi sebagai pembawa virus (di bawah usia 6-8 bulan, reaksi
serologis dapat disebabkan oleh antibodi ibu /maternal antibodies; status dapat
dikonfirmasi dengan teknik molekuler). Kuda yang terinfeksi adalah reservoir
virus potensial. Gigitan lalat adalah vektor mekanis virus di alam.
Identifikasi
agen: Virus dari kuda dapat diisolasi dengan menginokulasi darah tersangka ke
kuda yang rentan atau pada kultur leukosit yang dibuat dari kuda yang rentan.
Pengenalan infeksi pada kuda yang telah diinokulasi eksperimen dapat dilakukan
berdasarkan tanda klinis, perubahan hematologis dan respons antibodi positif
yang ditentukan oleh uji imunodifusi atau uji enzyme-linked immunosorbent assay
(ELISA) atau dengan teknik molekuler. Keberhasilan isolasi virus pada kultur
leukosit kuda telah terkonfirmasi dengan deteksi antigen EIA spesifik, dengan
uji imunofluoresensi, reaksi rantai polimerase, uji reverse-transcriptase, atau
dengan inokulasi cairan kultur ke dalam kuda yang rentan. Isolasi virus jarang
dicoba karena waktu, kesulitan dan termasuk biayanya.
Tes
serologis: Tes gel imunodifusi agar (AGID) dan ELISA adalah tes sederhana dan
terpercaya untuk menunjukkan infeksi EIAV. Bila ELISA positif mereka harus
dikonfirmasi menggunakan tes AGID. Antigen EIA dapat dibuat dari kultur jaringan
yang terinfeksi atau dengan menggunakan teknologi DNA rekombinan.
Persyaratan
untuk vaksin: Vaksin hidup yang dilemahkan, yang dikembangkan pada awal tahun
1970an, banyak digunakan di China (RRC) antara tahun 1975 dan 1990. Sejak itu,
strategi pengendalian EIA telah beralih dari vaksinasi ke karantina untuk
menghindari gangguan antibodi vaksinasi dengan tes diagnostik. Tidak ada vaksin
yang tersedia saat ini.
A. PENDAHULUAN
Equine
infecsious anaemia (EIA) terjadi di seluruh dunia. Infeksi, sebelumnya dikenal
sebagai demam rawa, terbatas pada hewan bangsa kuda (equidae). Penyakit ini
ditandai dengan episode demam berulang, trombositopenia, anemia, kehilangan
berat badan yang cepat dan edema dari bagian bawah tubuh. Jika kematian tidak
diakibatkan oleh salah satu serangan klinis akut, tahap kronis berkembang dan
infeksi cenderung menjadi tidak jelas. Masa inkubasi biasanya 1–3 minggu,
tetapi mungkin selama 3 bulan. Dalam kasus akut, kelenjar getah bening, limpa
dan hati hiperemik dan membesar. Secara histologis organ-organ ini
diinfiltrasikan dengan sarang limfosit dan sel plasma yang belum matang. Sel
Kupffer di hati sering mengandung haemosiderin atau eritrosit. Limpa yang
membesar bisa dirasakan pada pemeriksaan dubur. Diagnosis banding meliputi
equine viral arteritis (Bab 2.5.10), Anaplasma phagocytophilum, dan penyebab
edema lainnya, demam, anemia, atau trombositopenia /ekimosis.
Virus
EIA (EIAV) masuk di dalam genus Lentivirus di keluarga Retroviridae, subfamily
Orthoretrovirinae. Anggota lain dari genus termasuk: virus immunodeficiency
bovine; virus artrine arthritis ensefalitis; virus immunodefisiensi kucing; virus
human immunodeficiency 1; virus human immunodeficiency 2; dan virus maedi /visna.
Perbandingan urutan asam nukleat telah menunjukkan keterkaitan yang ditandai di
antara virus-virus ini.
Sekali
seekor kuda terinfeksi EIAV, darahnya tetap menular selama sisa hidupnya. Ini
berarti bahwa kuda adalah pembawa viraemik dan berpotensi menularkan infeksi ke
kuda lain (Cheevers & McGuire, 1985). Penularan terjadi melalui transfer
darah dari kuda yang terinfeksi. Di alam, penyebaran virus kemungkinan besar
melalui kuda memakan darah dari lalat yang mengisap darah kuda yang sakit
secara klinis dan kemudian pada kuda yang rentan. Penularan juga dapat terjadi
melalui transfer darah iatrogenik melalui penggunaan jarum yang terkontaminasi.
Infeksi utero janin dapat terjadi (Kemen & Coggins, 1972). Titer virus
lebih tinggi pada kuda dengan tanda-tanda klinis dan risiko penularan lebih tinggi
dari hewan-hewan ini dari pada hewan pembawa dengan titer virus yang lebih
rendah.
EIAV
tidak dianggap sebagai risiko bagi kesehatan manusia. Manipulasi laboratorium
harus dilakukan pada tingkat keamanan dan penahanan yang tepat yang ditentukan
oleh analisis biorisk (lihat Bab 1.1.4 Biosafety dan biosecurity: Standar untuk
mengelola risiko biologis di laboratorium hewan dan fasilitas hewan).
B. TEKNIK DIAGNOSA
Uji
Agar gel immunodiffusion (AGID) (Coggins et al., 1972) dan uji
enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) (Suzuki et al., 1982) adalah
uji yang akurat dan handal untuk mendeteksi EIA pada kuda, kecuali hewan di
tahap awal infeksi dan belo yang terinfeksi tersembunyi. Dalam keadaan langka
lainnya, hasil yang menyesatkan dapat terjadi ketika tingkat virus yang beredar
dalam darah selama episode akut penyakit cukup untuk mengikat antibodi yang
tersedia, dan jika tingkat antibodi awal tidak pernah naik cukup tinggi untuk
dapat dideteksi (Toma, 1980). Meskipun ELISA akan mendeteksi antibodi agak
lebih awal dan pada konsentrasi yang lebih rendah daripada tes AGID, ELISA
positif dikonfirmasi menggunakan tes AGID. Ini karena hasil positif palsu telah
tercatat dengan ELISAs. Uji AGID juga memiliki keunggulan membedakan antara EIA
dan reaksi antigen-antibodi non-EIA berdasarkan garis identitas.
Tabel.
Metode uji yang ada untuk mendiagnosa Equine infecsious anaemia
|
Method
|
Purpose
|
|||
|
Populasi
yang bebas dari infeksi /efficiensi
dari kebijakan erdikasi
|
Individu
hewan yang bebas dari infeksi
|
Confirmasi dari kasus klinis
|
Prevalensi dari
infeksi – surveillance
|
|
|
Identifikasi agen penyakit1
|
||||
|
PCR
|
–
|
+/–
|
+
|
–
|
|
Virus isolation/
horse inoculation
|
–
|
–
|
+
|
–
|
|
Deteksi respon imun
|
||||
|
AGID
|
++
|
++
|
++
|
++
|
|
ELISA
|
++
|
++
|
+
|
+
|
|
Immunoblot
|
–
|
++
|
++
|
–
|
Kunci:
+++ = metode yang disarankan; ++ = metode yang cocok; + = dapat digunakan dalam
beberapa situasi, tetapi biaya, keandalan, atau faktor lain sangat membatasi
penerapannya; - = tidak sesuai untuk tujuan ini.
Meskipun
tidak semua tes yang terdaftar sebagai kategori +++ atau ++ telah mengalami
validasi formal, sifat rutin mereka dan fakta bahwa mereka telah digunakan
secara luas tanpa hasil yang meragukan, membuatnya dapat diterima.
PCR
= polymerase chain reaction; AGID = agar gel immunodiffusion; ELISA =
enzyme-linked immunosorbent assay.
(1 =
Kombinasi metode identifikasi agen yang diterapkan pada sampel klinis yang sama
adalah direkomendasikan).
1. Identifikasi agen penyakit
1.1. Isolasi virus dan identifikasi
Isolasi
virus biasanya tidak diperlukan untuk mendiagnosa.
Isolasi
virus dari kuda tersangka dapat dilakukan dengan menginokulasi darah mereka ke kultur
leukosit yang dibuat dari kuda yang bebas infeksi. Produksi virus dalam kultur
dapat dikonfirmasi dengan deteksi antigen EIA spesifik oleh ELISA (Shane et
al., 1984), oleh uji imunofluoresensi (Weiland et al., 1982), oleh tes
molekuler atau dengan subinokulasi ke kuda yang rentan. Isolasi virus jarang
dilakukan karena kesulitan menumbuhkan kultur leukosit kuda.
Ketika
status pasti infeksi kuda tidak dapat dipastikan, inokulasi kuda yang rentan
dengan darah tersangka dapat digunakan. Dalam hal ini kuda yang sebelumnya
telah diuji untuk antibodi dan terbukti negatif diberikan transfusi darah
langsung dari kuda tersangka, dan status antibodi dan kondisi klinisnya
dimonitor setidaknya selama 45 hari. Biasanya, 1–25 ml darah lengkap yang
diberikan secara intravena cukup untuk menunjukkan infeksi, tetapi dalam kasus
yang jarang mungkin diperlukan untuk menggunakan volume darah yang lebih besar
(250 ml) atau leukosit yang dicuci dari volume seperti itu (Coggins &
Kemen, 1976) .
1.2. Polymerase chain reaction
Pengujian
nested polymerase chain reaction (PCR) untuk mendeteksi EIA proviral DNA dari
darah perifer kuda telah terjelaskan (Nagarajan & Simard, 2001). Metode nested
PCR didasarkan pada urutan primer dari daerah gag genom proviral. Ini telah
terbukti sebagai teknik sensitif untuk mendeteksi strain lapangan EAV dalam sel
darah putih kuda yang terinfeksi EIA; batas bawah deteksi biasanya sekitar 10
salinan genom DNA target (Nagarajan & Simard, 2001; 2007). Sebuah tes PCR
reverse-transcriptase real-time juga telah dijelaskan (Cook et al., 2002).
Untuk mengkonfirmasi hasil dari tes yang sangat sensitif ini, disarankan agar
sampel duplikat dari setiap spesimen diagnostik diproses. Karena risiko
kontaminasi silang, juga penting bahwa prosedur yang tepat diikuti (lihat Bab
1.1.5 Manajemen kualitas di laboratorium pengujian hewan dan Bab 1.1.6 Prinsip
dan metode validasi tes diagnostik untuk penyakit infeksi).
Berikut
ini adalah beberapa keadaan di mana PCR assay mungkin berguna untuk mendeteksi
infeksi EIAV pada kuda:
i)
Hasil yang bertentangan pada tes serologi;
ii)
Diduga infeksi tetapi hasil serologi negatif atau dipertanyakan;
iii)
Uji komplementer terhadap serologi untuk konfirmasi hasil positif;
iv)
Konfirmasi infeksi awal, sebelum antibodi serum untuk EIAV berkembang;
v) Memastikan
bahwa kuda yang akan digunakan untuk antiserum atau produksi vaksin atau
sebagai donor darah bebas dari EIAV;
vi)
Konfirmasi status anak kuda dari kuda yang terinfeksi.
2. Uji Serologi
Karena
persistensi EIAV dalam hewan equidae yang terinfeksi, deteksi antibodi serum
untuk EIAV mengkonfirmasi diagnosis infeksi dari EIAV.
2.1. Uji Agar gel immunodiffusion (uji
wajib untuk perdagangan international)
Antibodi
pemicu diproduksi dengan cepat sebagai akibat dari infeksi EIA, dan dapat
dideteksi oleh tes AGID. Reaksi spesifik ditunjukkan oleh garis precipitin
antara antigen EIA dan serum tes dan dikonfirmasi oleh identitas mereka dengan
reaksi antara antigen dan serum standar positif.
Reagen
untuk AGID tersedia secara komersial dari beberapa perusahaan. Sebagai
alternatif, antigen AGID dan serum referensi dapat disiapkan seperti yang
dijelaskan di bawah ini.
2.1.1. Preparasi dari antigen
Antigen
EIA spesifik dapat dibuat dari limpa kuda yang terinfeksi akut (Coggins et al.,
1973), dari kultur jaringan kuda yang terinfeksi (Malmquist et al., 1973), dari
garis sel thymus anjing yang terus menerus terinfeksi (Bouillant et al., 1986),
atau dari protein yang diekspresikan pada bakteri atau baculovirus menggunakan
teknik DNA rekombinan (Archambault et al., 1989; Kong et al., 1997). Persiapan
dari kultur yang terinfeksi atau dari teknik DNA rekombinan memberikan hasil
yang lebih seragam dari pada penggunaan sel limpa dan memungkinkan untuk
standarisasi reagen yang lebih baik.
Untuk
mendapatkan antigen yang memuaskan dari limpa, seekor kuda harus terinfeksi
strain EIAV yang sangat ganas. Masa inkubasi yang dihasilkan harus 5-7 hari,
dan limpa harus dikumpulkan 9 hari setelah inokulasi, ketika titer virus berada
pada puncaknya dan sebelum jumlah antibodi yang dapat dipicu diproduksi. Pulpa
limpa murni digunakan dalam tes immunodiffusion sebagai antigen (Coggins et
al., 1973). Ekstraksi antigen dari limpa dengan larutan garam dan konsentrasi
dengan amonium sulfat tidak memberikan sebagai antigen yang memuaskan seperti
pemilihan limpa dengan titer yang sangat tinggi dari antigen EIA.
Sebagai
alternatif, ginjal janin kuda atau sel kulit atau sel thymus anjing terinfeksi
dengan strain EIAV yang diadaptasi untuk tumbuh dalam kultur jaringan (American
Type Culture Collection, atau strain Cina yang disesuaikan dengan sel ulit
janin kuda). Virus dikumpulkan dari kultur dengan pengendapan dengan 8%
polietilena glikol atau dengan pelleting oleh ultrasentrifugasi. Antigen
diagnostik, p26, dilepaskan dari virus oleh pengobatan dengan deterjen atau
eter (Malmquist et al., 1973). Protein inti EIAV, dinyatakan dalam bakteri atau
baculovirus, tersedia secara komersial dan praktis untuk digunakan sebagai
antigen berkualitas tinggi untuk diagnosis serologis.
P26
adalah protein struktural internal dari virus yang dikodekan oleh gen gag. P26
lebih stabil secara antigenik di antara strain EIAV dibandingkan virion
glikoprotein gp45 dan gp90 (Montelaro et al., 1984). Ada bukti variasi regangan
dalam urutan asam amino p26; namun tidak ada bukti yang menunjukkan bahwa
variasi ini mempengaruhi tes diagnostik serologis apa pun (Zhang et al., 1999).
2.1.2. Preparasi dari standar
antiserum
Antiserum
positif yang diketahui dapat dikumpulkan dari kuda yang sebelumnya terinfeksi
EIAV. Serum ini harus menghasilkan satu garis presipitasi tunggal yang spesifik
untuk EIA, seperti yang ditunjukkan oleh reaksi identitas dengan serum standar
yang diketahui. Sangat penting untuk menyeimbangkan konsentrasi antigen dan antibodi
untuk memastikan kepekaan tes yang optimal. Konsentrasi reagen harus
disesuaikan untuk membentuk garis presipitasi yang sempit kira-kira berjarak
sama antara dua sumur yang mengandung antigen dan serum.
2.1.3. Prosedur uji (Association
francaise de Normalisation /AFNOR/, 200; Coggins et al., 1973; Pearson coggin,
1979)
i)
Reaksi Immunodiffusi dilakukan dalam lapisan agar pada cawan Petri. Untuk cawan
Petri berdiameter 100 mm, 15–17 ml 1% agar noble dalam 0,145 M buffer borat (9
g H3BO3, ditambah 2 g NaOH per liter), pH 8,6 (± 0,2) digunakan. Enam sumur
dilubangi agar-agar di sekitar pusat sumur dengan diameter yang sama. Sumurnya
berdiameter 5,3 mm dan 2,4 mm terpisah. Setiap sumur harus mengandung volume
reagen yang sama.
ii)
Antigen ditempatkan di sumur tengah dan antiserum standar ditempatkan di sumur
eksterior alternatif. Sampel serum untuk pengujian ditempatkan di tiga sumur
tersisa.
iii)
Piring dipertahankan pada suhu kamar di lingkungan yang lembab.
iv)
Setelah 24-48 jam, reaksi pengendapan diperiksa melalui sinar sempit yang
intens, cahaya oblik dan dengan latar belakang hitam. Garis referensi harus
terlihat jelas pada 24 jam, dan pada saat itu sera tes apa pun yang sangat
positif mungkin juga telah membentuk garis identitas dengan yang ada di antara
pereaksi standar. Reaksi positif yang lemah dapat membutuhkan waktu 48 jam
untuk terbentuk dan ditandai dengan sedikit lentur dari garis presipitasi serum
standar antara sumur antigen dan serum uji dengan baik. Sera dengan titer
antibodi yang tinggi dapat membentuk pita precipitin yang lebih luas yang
cenderung difus. Reaksi tersebut dapat dikonfirmasikan sebagai spesifik untuk EIA
dengan pengenceran pada 1/2 atau 1/4 sebelum pengujian ulang; ini kemudian
memberikan garis identitas yang lebih berbeda. Sera tanpa antibodi EIA tidak
akan membentuk garis pengendapan dan tidak akan berpengaruh pada garis reaksi
dari reagen standar.
v)
Interpretasi hasil: Kuda yang berada pada tahap awal infeksi mungkin tidak
memberikan reaksi serologis positif dalam tes AGID. Hewan seperti itu harus diambil
darahnya lagi setelah 3–4 minggu. Untuk membuat diagnosis pada anak kuda muda,
mungkin perlu untuk menentukan status antibodi yang ringan. Jika kuda melewati
antibodi EIA pada anak kuda melalui kolostrum, maka jangka waktu 6 bulan atau
lebih setelah lahir harus diizinkan agar antibodi maternal berkurang. Pengujian
sekuensial pada anak kuda pada interval bulanan mungkin berguna untuk mengamati
penurunan antibodi maternal. Untuk menyimpulkan bahwa anak kuda tidak
terinfeksi, hasil negatif harus diperoleh (setelah hasil positif awal)
setidaknya 2 bulan setelah memisahkan kuda dari kontak dengan kuda betina
positif EIA atau kuda positif lainnya. Sebagai alternatif, PCR dapat dilakukan
pada darah anak kuda untuk menentukan ada / tidaknya proivirus EIA.
2.2. Enzym-linked immunosorbent assay
Ada
empat ELISA yang disetujui oleh Departemen Pertanian Amerika Serikat untuk
diagnosis anemia infeksi kuda dan tersedia secara internasional; ELISA
kompetitif dan tiga ELISAs non-kompetitif. ELISA kompetitif dan dua ELISAs
non-kompetitif mendeteksi antibodi yang dihasilkan terhadap antigen protein
inti p26. ELISA non-kompetitif ketiga menggabungkan protein p26 inti dan gp45
(virus transmembran protein). Protokol ELISA khas digunakan dalam semua uji.
Jika bahan ELISA komersial tidak tersedia, ELISA non-kompetitif menggunakan
antigen p26 yang dimurnikan dari bahan kultur sel dapat digunakan (Shane et
al., 1984).
Hasil
uji positif oleh ELISA harus diuji ulang menggunakan tes AGID untuk
mengkonfirmasi diagnosis karena beberapa hasil positif palsu telah tercatat
dengan ELISA. Hasilnya juga dapat dikonfirmasi dengan teknik imunoblot.
Antiserum standar untuk imunodifusi, yang mengandung jumlah antibodi minimum
yang harus dideteksi oleh laboratorium, tersedia dari Laboratorium Referensi
OIE (lihat Tabel yang diberikan dalam Bagian 4 dari Pedoman Terestrial ini).
Metode seragam untuk pengendalian EIA telah dipublikasikan (Departemen Pertanian
Amerika Serikat [USDA], 2002).
C. PERSYARATAN UNTUK VAKSIN
Vaksin
subunit EIAV dan yang tidak diaktivasi
diuji di laboratorium yang berbeda dan terbukti hanya melindungi infeksi strain
prototipe homolog. Vaksin hidup yang dilemahkan, dikembangkan pada awal tahun
1970-an, telah digunakan secara luas di Tiongkok (Republikan Rakyat) antara
1975 dan 1990 dan efektif dalam mengendalikan prevalensi EIA. Dengan prevalensi
rendah sejak tahun 1990, strategi untuk pengendalian EIA telah bergeser dari
vaksinasi ke karantina untuk menghindari gangguan antibodi vaksin dengan tes
diagnostik.
Meskipun
tidak ada masalah keamanan yang timbul dengan penggunaan vaksin EIAV yang
dilemahkan di Cina, perlu dicatat bahwa, seperti lentivirus lainnya, EIAV
sangat bisa berubah dan dapat berintegrasi ke dalam genom inang /hospes.
Penggunaan vaksin EIAV hidup perlu sangat hati-hati dan dievaluasi dengan
hati-hati.
Penulis,
Disadur
oleh drh Giyono Trisnadi, Sumber: Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for
Terrestrial Animals OIE 2018.
*Catatan,
bagi yang memerlukan TulIsan secara lengkap beserta daftar pustakanya silakan
mengubungi penulis dengan email trisnadidrh@gmail.com
******
Tidak ada komentar:
Posting Komentar