Virus Eastern
dan Western Equine Encephalomyelitis adalah penyakit pada kuda yang disebabkan
oleh virus dari genus Alphavirus dan famili Togaviridae. yang di tandai dengan demam,
anoreksia, dan depresi berat, dalam kasus yang parah penyakit pada kuda
berkembang menjadi hiperexcitability, kebutaan, depresi, kejang, dan mati. Penyakit ini belum ada obatnya.
******
EQUINE ENCEPHALOMYELITIS
(Eastern and Western)
RINGKASAN
Virus Eastern
dan Western Equine Encephalomyelitis (encephalomyelitis kuda Timur dan Barat)
termasuk ke dalam genus Alphavirus dari keluarga Togaviridae. Infeksi alternatif
pada burung dan nyamuk melestarikan virus ini di alam. Penyakit ini terjadi
secara sporadis pada kuda dan manusia dari pertengahan musim panas hingga akhir
musim gugur. Kuda dan manusia adalah hospes dead-end. Penyakit ini pada kuda
ditandai dengan adanya demam, anoreksia, dan depresi berat. Dalam kasus yang
parah, penyakit pada kuda berkembang menjadi hiperexcitability, kebutaan,
ataksia, depresi mental yang berat, recumbency, kejang, dan kematian. Infeksi
virus equine encephalomyelitis timur (EEE) pada kuda sering berakibat fatal,
sementara virus Western Equine Encephalomyelitis (WEE) dapat menyebabkan
penyakit subklinis atau ringan dengan mortalitas kurang dari 30%. EEE dan WEE
telah dilaporkan menyebabkan penyakit pada unggas, burung lomba dan ratite
(burung besar yang tidak bisa terbang). Kasus EEE sporadis telah dilaporkan
pada sapi, domba, babi, rusa, dan anjing.
Identifikasi
agen: Diagnosis dugaan terhadap EEE atau WEE dapat dibuat ketika kuda yang
rentan menunjukkan gejala khas dan tanda-tanda lain penyakit neurologis di area
di mana serangga hematophagous aktif. Tidak ada karakteristik lesinya. Lesi
histopatologi dapat memberikan diagnosis dugaan. Virus EEE biasanya dapat
diisolasi dari otak dan kadang-kadang jaringan lain dari kuda mati, namun virus
WEE jarang diisolasi. Virus EEE dan WEE dapat diisolasi dari spesimen lapangan
dengan menginokulasi tikus yang baru lahir, telur berembryo, kultur sel, atau
ayam yang baru menetas. Virus ini diidentifikasi dengan complement fixation
(CF), immunofluorescence, atau plaque reduction neutralisation (PRN) tests. RNA
virus EEE dan WEE juga dapat dideteksi dengan metode reverse-transcription
polymerase chain reaction.
Tes serologis:
Antibodi dapat diidentifikasi dengan PRN, inhibisi haemagglutination (HI), tes
CF, atau IgM capture enzyme-linked immunosorbent assay.
Persyaratan
untuk vaksin: Vaksin EEE dan WEE aman dan imunogenik. Mereka diproduksi dalam
kultur sel dan diinaktivasi dengan formalin.
A. PENDAHULUAN
Virus Eastern
equine encephalomyelitis (EEE) dan Western equine encephalomyelitis (WEE)
adalah anggota genus Alphavirus dari keluarga Togaviridae. Ekologi alami untuk
pemeliharaan virus terjadi melalui infeksi alternatif burung dan nyamuk
ornithophilic. Virus EEE juga telah diisolasi dari ular, dan ini mungkin
memiliki peran sebagai penampung reservoir (Bingham et al., 2012). Penyakit
klinis dapat diamati pada manusia dan kuda, keduanya merupakan inang akhir bagi
agen-agen ini. EEE telah didiagnosis di Quebec dan Ontario di Kanada, wilayah
tengah dan timur Amerika Serikat (AS), Kepulauan Karibia, Meksiko, dan Amerika
Tengah dan Selatan. Penyakit yang disebabkan oleh virus WEE telah dilaporkan di
Amerika Serikat bagian barat dan Kanada, Meksiko, dan Amerika Tengah dan
Selatan (Morris, 1989; Reisen & Monath, 1989; Walton et al., 1981). Virus
Highlands J, antigen terkait dengan WEE virus, telah diisolasi di Amerika
Serikat bagian timur. Meskipun virus Highlands J umumnya diyakini tidak
menyebabkan penyakit pada mamalia, virus ini telah diisolasi dari otak kuda
yang mati akibat ensefalitis di Florida (Karabatsos et al., 1988).
Meskipun
angka kematian lebih rendah untuk WEE, tanda-tanda klinis EEE dan WEE bisa
identik. Penyakit yang disebabkan oleh virus juga dikenal sebagai penyakit
tidur. Setelah periode inkubasi 5-14 hari, tanda-tanda klinis termasuk demam,
anoreksia, dan depresi. Diagnosis dugaan infeksi virus EEE atau WEE pada kuda
yang tidak divaksin dapat dilakukan jika karakteristik mengantuk teramati
selama musim panas di daerah beriklim sedang atau musim hujan di iklim tropis
dan subtropis, ketika vektor nyamuk berlimpah. Namun, sejumlah penyakit lain,
seperti virus West Nile dan Venezuelan equine encephalomyelitis (bab 2.1.24 dan
2.5.12, masing-masing), menghasilkan tanda-tanda klinis yang serupa dan
diagnosis harus dikonfirmasi dengan metode uji diagnostik yang terjelaskan. WEE
Infeksi virus pada kuda sering teramati pada area geografis yang luas, misalnya
kasus sporadis di atas 1000 mil persegi. Infeksi virus EEE biasanya teramati di
wilayah geografis yang terbatas. Peristiwa terisolasi dari kematian tinggi pada
burung-burung buruan, terutama pheasant, chukars, penguin akuarium, dan burung
puyuh telah ditelusuri untuk WEE, EEE, atau infeksi virus Highlands J (Morris,
1989; Reisen & Monath, 1989; Tuttle et al., 2005). Sebagian besar infeksi
encephalomyelitis pada unggas domestik disebabkan oleh virus EEE dan terjadi di
negara-negara pantai timur Amerika Serikat. Virus ini dimasukkan oleh nyamuk,
tetapi penularan di dalam kawanan terutama dilakukan oleh pengambilan bulu dan
kanibalisme. Baik virus EEE dan WEE telah menyebabkan penyakit fatal pada burung
bangsa ratite. Enteritis hemoragik telah diamati pada burung emus yang
terinfeksi virus EEE dan WEE, dan angka morbiditas dan mortalitas mungkin lebih
besar dari 85%. Virus Highlands J dan EEE telah ditemukan dengan gejala
depresi, somnolen, penurunan produksi telur, dan peningkatan mortalitas pada
kalkun (Guy, 1997). EEE virus telah dilaporkan menyebabkan penyakit pada sapi
(McGee et al., 1992; Pursell et al., 1976), domba (Bauer et al., 2005), babi
(Elvinger et al., 1996), rusa berekor putih (Tate et al., 2005), dan anjing
(Farrar et al., 2005).
Virus
EEE menyebabkan penyakit berat pada manusia dengan tingkat mortalitas 30–70%
dan frekuensi lanjutan permanen yang tinggi pada pasien yang bertahan hidup.
WEE biasanya ringan pada manusia dewasa, tetapi bisa menjadi penyakit berat
pada anak-anak. Tingkat kematian adalah antara 3 dan 14%. Infeksi berat dan
kematian yang disebabkan oleh virus EEE dan WEE telah dilaporkan pada pekerja
laboratorium. Manipulasi laboratorium harus dilakukan pada tingkat keamanan dan
penahanan yang tepat yang ditentukan oleh analisis biorisk (lihat Bab 1.1.4
Biosafety dan biosecurity: Standar untuk mengelola risiko biologis di
laboratorium hewan dan fasilitas hewan). Dianjurkan agar personel diimunisasi
terhadap virus EEE dan WEE (Departemen Kesehatan dan Layanan Kemanusiaan
Amerika Serikat, 1999). Tindakan pencegahan juga harus diambil untuk mencegah
infeksi manusia saat melakukan pemeriksaan post-mortem pada kuda yang diduga
terinfeksi oleh virus encephalomyelitis kuda.
B. TEKNIK DIAGNOSIS
Table
1. metode Uji yang tersedia untuk mendiagnosis Eastern equine encephalomyelitis
dan tujuannya
Methoda
|
Tujuan
|
|||||
Populasi bebas dari infeksi
|
Individu hewan bebas dari nfeksi
|
Confirmasi
dari kasus klinis
|
Prevalensi
infeksi – surveillance
|
Status Immune pada hewan individu atau popolasi setelah
vaksinasi
|
||
Identifikasi Agen 1
|
||||||
RT-PCR
|
–
|
++
|
+++
|
–
|
–
|
|
Isolation
dalam kultur jaringan
|
–
|
++
|
+++
|
–
|
–
|
|
Deteksi respon immune
|
||||||
Immunohisto-kimia
|
–
|
++
|
+++
|
–
|
–
|
|
IgM capture ELISA
|
–
|
+
|
++
|
–
|
–
|
|
Plaque reduction neutralisation
|
+++
|
+
|
++
|
+++
|
+++
|
|
Hemagglutination
inhibition
(samples berpasangan)
|
+
|
++
|
++
|
++
|
++
|
|
Complement fixation
(samples berpasangan)
|
–
|
+
|
++
|
–
|
–
|
|
Kunci:
+++ = metode yang disarankan; ++ = metode yang cocok; + = dapat digunakan dalam
beberapa situasi, tetapi biaya, keandalan, atau faktor lain sangat membatasi
penerapannya; - = tidak sesuai untuk tujuan ini. Meskipun tidak semua tes yang
terdaftar sebagai kategori +++ atau ++ telah mengalami validasi formal, sifat
rutin mereka dan fakta bahwa mereka telah digunakan secara luas tanpa hasil
yang meragukan, membuatnya dapat diterima.
RT-PCR
= reverse-transcription polymerase chain reaction; ELISA = enzyme-linked
immunosorbent assay.
*
Meskipun metode diagnostik untuk ensefalomielitis kuda barat sama, tidak semua
modalitas uji telah dievaluasi secara menyeluruh pada kuda yang secara alami
terinfeksi WEE.
(1 = Kombinasi metode identifikasi agen yang
diterapkan pada sampel klinis yang sama yang direkomendasikan)
1. Identifikasi agen
Metode
definitif untuk diagnosis EEE atau WEE adalah isolasi virus. Virus EEE biasanya
dapat diisolasi dari otak kuda, kecuali lebih dari 5 hari telah berlalu antara
munculnya tanda-tanda klinis dan kematian kuda. Virus EEE sering dapat
diisolasi dari jaringan otak bahkan dengan adanya titer antibodi serum yang
tinggi. Virus WEE jarang diisolasi dari jaringan kuda yang terinfeksi. Otak
adalah jaringan pilihan untuk isolasi virus, tetapi virus telah terisolasi dari
jaringan lain, seperti hati dan limpa. Disarankan bahwa satu set lengkap
jaringan-jaringan ini dikumpulkan dalam rangkap dua, satu set untuk isolasi
virus dan yang lain ditetapkan dalam formalin untuk pemeriksaan histopatologi.
Spesimen untuk isolasi virus harus dikirim dalam lemari es jika mereka dapat
diterima di laboratorium dalam waktu 48 jam pengumpulan; jika tidak, mereka
harus dibekukan dan dikirim dengan es kering. Satu set lengkap jaringan akan
memungkinkan kinerja teknik diagnostik untuk penyakit lain. Untuk isolasi,
suspensi 10% dari jaringan disiapkan dalam fosfat buffered saline (PBS), pH
7.8, mengandung bovine serum albumin (BSA) (fraksi V; 0,75%), penicillin (100
unit /ml), dan streptomisin (100 µg /ml). Suspensinya diklarifikasi dengan
sentrifugasi pada 1500 g selama 30 menit.
Virus
EEE dan WEE dapat diisolasi dalam sejumlah sistem kultur sel. Kultur sel yang
paling umum digunakan adalah primer fibroblas embrio ayam atau bebek, continuous
cell lines ginjal monyet hijau Afrika (Vero), ginjal kelinci (RK-13), atau
ginjal bayi hamster (BHK-21). Isolasi biasanya dicoba dalam labu sel 25 cm2.
Sel-sel konfluen diinokulasi dengan 1,0 ml suspensi jaringan. Setelah periode
penyerapan 1-2 jam, media pemeliharaan ditambahkan. Kultur diinkubasi selama
6-8 hari, dan satu blind pasase dibuat. Virus EEE dan WEE akan menghasilkan
perubahan cytopathic dalam kultur sel. Kultur yang tampaknya terinfeksi
membeku. Cairan dari kultur yang ditawing digunakan untuk identifikasi virus.
Tikus umur
sehari juga dianggap sebagai sistem host yang sensitif. Inokulasi intrakranial
satu atau dua liter tikus umur 1-4 hari dengan 0,02 ml inokulum menggunakan
jarum 26-gauge 3/8 inci (9,3 mm) yang melekat pada jarum suntik tuberkulin 1
ml. Sisi inokulasi hanya lateral ke garis tengah ke bagian tengah dari satu
belahan lateral. Mencit diamati selama 10 hari. Tikus yang mati dalam 24 jam
setelah inokulasi dibuang. Dari 2 hingga 10 hari pascainokulasi, tikus mati
dikumpulkan setiap hari dan dibekukan pada suhu -70 °C. Otak tikus dipanen
untuk identifikasi virus dengan aspirasi menggunakan jarum 20 inci 1 inci (2,5
cm) yang melekat pada jarum suntik tuberkulin 1 ml. Bagian kedua dibuat hanya
jika virus tidak dapat diidentifikasi dari tikus yang mati setelah inokulasi.
Embrio
ayam dianggap kurang sensitif daripada tikusnumur sehari ketika digunakan untuk
isolasi utama virus EEE dan WEE. Suspensi jaringan dapat diinokulasi oleh rute
kuning telur ke dalam telur ayam embrio berumur 6-8 hari. Tidak ada tanda-tanda
diagnostik atau lesi pada embrio yang terinfeksi virus ini. Embrio yang
diinokulasi harus diinkubasi selama 7 hari, tetapi kematian biasanya terjadi
antara 2 dan 4 hari setelah diinokulasi. Biasanya hanya satu bagian yang dibuat
kecuali ada embrio mati dari mana virus tidak dapat diisolasi. Ayam yang baru
menetas rentan dan telah digunakan untuk isolasi virus. Jika metode ini
digunakan, tindakan pencegahan harus diambil untuk mencegah paparan aerosol
personil laboratorium, karena burung yang terinfeksi dapat menumpahkan virus
yang sangat menular.
EEE atau WEE virus
dapat diidentifikasi pada tikus yang terinfeksi atau otak ayam, cairan kultur
sel, atau cairan amnionik-alantoic oleh fiksasi komplemen. Suspensi otak 10%
disiapkan dalam buffer veronal (barbitone); cairan kultur telur dan sel
digunakan murni atau diencerkan 1/10 dalam buffer veronal. Cairan atau suspensi
disentrifugasi pada 9000 g selama 30 menit, dan cairan supernatan diuji terhadap
serum serebral atau cairan asites tikus yang disiapkan terhadap virus EEE dan
WEE menggunakan prosedur CF standar (Departemen Kesehatan, Pendidikan, dan
Kesejahteraan Amerika Serikat, 1974). Tes CF membutuhkan inkubasi semalam pada
4 °C serum-antigen dengan 7 unit komplemen. Virus dapat diidentifikasi dalam
kultur sel dengan pewarnaan imunofluoresen langsung. Metode identifikasi virus yang
kurang umum digunakan adalah uji netralisasi, seperti diuraikan di bawah ini.
Metode
reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) untuk mendeteksi EEE,
WEE dan VEE virus asam nukleat pada nyamuk dan jaringan vertebrata telah
dijelaskan, meskipun beberapa telah divalidasi secara luas untuk sampel mamalia
(Lambert et al., 2003; Linssen et al., 2000; Monroy et al., 1996; Vodkin et
al., 1993). Metode multipleks RT-PCR dikembangkan untuk mempercepat diagnosis
banding dalam kasus dugaan EEE atau West Nile arboviral encephalomyelitis pada
kuda (Johnson et al., 2003). Uji ini telah meningkatkan kecepatan dan kepekaan dibandingkan
dengan isolasi virus kultur sel dan telah digunakan secara efektif di AS selama
beberapa musim arbovirus baru-baru ini. Baru-baru ini, kombinasi RT-PCR dengan
assay immunosorbent terkait enzim (ELISA: RT-PCR-ELISA) dilaporkan sebagai
metode untuk mengidentifikasi alpha-virus yang patogen terhadap manusia (Wang
et al., 2006).
Antigen-capture
ELISA telah dikembangkan untuk surveillance EEE pada nyamuk. Ini dapat
digunakan di negara-negara yang tidak memiliki fasilitas untuk isolasi virus
atau RT-PCR (Brown et al., 2001). Prosedur Immunohistokimia (IHC) sangat
berguna untuk diagnosis EEE karena mereka dilakukan pada jaringan tetap (Pennick
et al., 2012). Amplop protein EEEV ditargetkan di IHC. Area nekrotik dan
peradangan otak diperiksa. Pada kuda EEEV yang terinfeksi, pewarnaan positif teramati
terutama pada neuron dan proses dendritik terkait.
2. Tes serologis
Konfirmasi
serologis infeksi virus EEE atau WEE membutuhkan peningkatan atau penurunan
empat kali lipat titer antibodi pada sampel serum yang terkumpul yang terpisah
dalam 10-14 hari. Sebagian besar kuda yang terinfeksi virus EEE atau WEE
memiliki titer antibodi yang tinggi ketika penyakit klinis teramati. Akibatnya,
diagnosis dugaan dapat dilakukan jika kuda yang tidak divaksinasi dengan tanda
klinis yang tepat memiliki antibodi hanya terhadap virus EEE atau WEE. Deteksi
antibodi IgM oleh ELISA juga dapat memberikan diagnosis dugaan infeksi akut
(Sahu et al., 1994). Uji plaque
reduction neutralisation (PRN)
atau, lebih disukai, kombinasi tes PRN dan haemagglutination inhibition (HI)
adalah prosedur yang paling umum digunakan untuk mendeteksi antibodi terhadap
virus EEE dan WEE. Mungkin ada reaksi silang antara antibodi terhadap virus EEE
dan WEE dalam tes CF dan HI. Antibodi CF terhadap virus EEE dan WEE muncul
kemudian dan tidak berlanjut; akibatnya, itu kurang bermanfaat untuk diagnosis
serologis penyakit.
2.1. Fiksasi pelengkap
Tes CF
sering digunakan untuk menunjukkan adanya antibodi, meskipun antibodi yang
terdeteksi oleh tes CF tidak dapat bertahan selama yang dideteksi oleh tes HI
atau PRN. Ekstrak otak tikus sukrosa /acetone biasanya digunakan sebagai
antigen. Antigen positif diinaktivasi oleh treatmen dengan 0,1% beta-propiolactone.
Dengan
tidak adanya serum standar internasional, antigen harus dititrasi terhadap
serum kontrol positif yang disiapkan secara lokal. Antigen normal, atau antigen
kontrol, adalah otak tikus dari tikus yang tidak diinokulasi yang diekstraksi
dan diencerkan dengan cara yang sama.
Sera
diencerkan 1/4 dalam salin buffer veronal yang mengandung 1% gelatin (VBSG),
dan diinaktivasi pada 56 °C selama 30 menit. Titrasi sera positif dapat
dilakukan dengan menggunakan pengenceran dua kali lipat tambahan. Antigen CF
dan antigen kontrol (otak tikus normal) dilarutkan dalam VBSG ke jumlah fiksasi
optimal sebagaimana ditentukan oleh titrasi terhadap sera positif; komplemen
marmut diencerkan dalam VBSG mengandung 5 komplemen haemolytic unit-50% (CH50).
Sera, antigen, dan komplemen direaksikan di dasar microtitre plates 96 sumur
pada 4 °C selama 18 jam. Sel darah merah domba (SRBCs) distandardisasi menjadi
2,8% konsentrasi. Haemolysin dititrasi untuk menentukan pengenceran optimal
untuk banyak komplemen yang digunakan. Haemolysin digunakan untuk sensitisasi
2,8% SRBCs dan sel-sel peka ditambahkan ke semua sumur di plate microtitre. Uji
diinkubasi selama 30 menit pada 37 °C. Pelat kemudian disentrifugasi (200 g),
dan sumur diberi skor untuk adanya hemolisis. Kontrol berikut digunakan: (a)
serum dan serum kontrol masing-masing dengan 5 CH50 dan 2,5 CH50 pelengkap; (B)
CF antigen dan kontrol antigen masing-masing dengan 5 CH50, dan 2,5 CH50
pelengkap; (c) pelengkap pengenceran 5 CH50, 2,5 CH50, dan 1,25 CH50; dan (d)
kontrol sel dengan hanya SRBC dan pengencer VBSG. Tes kontrol ini untuk
anticomplementer serum dan anticomplementer antigen, aktivitas komplemen yang
digunakan dalam tes, dan integritas sistem indikator SRBC tanpa adanya
pelengkap, masing-masing.
Untuk
menghindari efek anticomplementer, serum harus dipisahkan dari darah sesegera
mungkin. Kontrol serum positif dan negatif harus digunakan dalam uji.
2.2. Haemagglutination inhibition
Antigen
untuk tes HI sama seperti yang dijelaskan di atas untuk tes CF. Antigen
diencerkan sehingga jumlah yang digunakan dalam setiap unit haemagglutin (HAU)
adalah dari empat hingga delapan kali yang mana aglutinasinya 50% dari sel
darah merah dalam sistem uji. Uji hemaglutinasi dan pH optimum untuk setiap
antigen ditentukan dengan sel darah merah angsa yang dilarutkan dalam larutan
pH mulai dari pH 5,8 hingga pH 6,6, pada interval 0,2.
Sera
diencerkan 1/10 dalam borat saline, pH 9,0, dan kemudian diinaktivasi pada 56 °C
selama 30 menit. treatmen kaolin digunakan untuk menghilangkan inhibitor serum
nonspesifik. Alternatif lain, inhibitor nonspesifik dapat dihilangkan dengan
perlakuan aseton serum dilarutkan 1/10 dalam PBS diikuti oleh rekonstitusi
dalam borat saline. Sera harus diserap sebelum digunakan dengan inkubasi dengan
0,05 ml volume sel darah putih yang dicuci dan dicuci selama 20 menit pada 4 °C.
Setelah
inaktivasi panas, treatmen kaolin dan absorpsi, pengenceran dua kali lipat dari
serum yang dirawat disiapkan dalam borat saline, pH 9,0 dengan 0,4% bovalbumin.
Pengenceran serum (0,025 ml /well) disiapkan dalam dasar plate mikrotiter 96-sumur
dalam pengenceran dua kali lipat dalam borat saline , pH 9,0, dengan 0,4 % bovalbumin.
Antigen (0,025 ml /well) ditambahkan ke serum. Plate diinkubasi pada 4 °C
semalam. Sel darah merah berasal dari angsa jantan putih dan dicuci tiga kali
dalam dekstrosa /gelatin /veronal (DGV), dan suspensi 7,0% disiapkan di DGV.
Suspensi 7,0% kemudian diencerkan 1/24 dalam larutan pH yang sesuai, dan 0,05
ml per sumur ditambahkan segera ke plate. Plate diinkubasi selama 30 menit pada
37 °C. Kontrol serum positif dan negatif dimasukkan ke dalam setiap uji. Uji
dianggap sah hanya jika kontrol sera memberikan hasil yang diharapkan. Titer
dari 1/10 dan 1/20 dicurigai, dan titer dari 1/40 dan di atas adalah positif.
2.3. Enzyme-linked immnunosorbent
assay
ELISA
dilakukan dengan mengcoating plate dasar datar dengan antibodi penangkap IgM
anti-equine (Sahu et al., 1994). Antibodi diencerkan sesuai dengan rekomendasi
manufaktur di 0,5 M buffer karbonat, pH 9,6, dan 50 μl ditambahkan ke setiap sumur.
Pelat diinkubasi pada 37 °C selama 1 jam, dan kemudian pada 4 °C semalam.
Sebelum digunakan, plate yang dilapisi dicuci tiga kali dengan 200–300 μl /well
0,01 M PBS yang mengandung 0,05% Tween 20. Setelah pencucian kedua, 200 µl /well
PBS /Tween /5% susu tanpa lemak kering ditambahkan dan piring diinkubasi pada
suhu kamar selama 1 jam. Setelah inkubasi, piring dicuci lagi tiga kali dengan
PBS /Tween. Uji dan kontrol sera diencerkan 1/400 dalam 0,01 M PBS, pH 7,2,
mengandung 0,05% Tween 20, dan 50 μl ditambahkan ke setiap sumur. Pelat
diinkubasi pada 37 °C selama 90 menit dan kemudian dicuci tiga kali.
Selanjutnya, 50 µl antigen virus ditambahkan ke semua sumur. (Pengenceran
antigen akan tergantung pada sumber dan harus ditentukan secara empiris.) Pelat
diinkubasi semalaman pada 4 °C, dan dicuci tiga kali. Kemudian, 50 μl horseradish-peroxidase-terkonjugasi
monoclonal antibody (MAb) ke encephalitis virus3 ditambahkan. Pelat diinkubasi
selama 90 menit pada 37 °C dan kemudian dicuci enam kali. Akhirnya, 50 µl ABTS
yang baru disiapkan (2,2'-Azino-bis- [3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulphonic
acid]) substrat + hidrogen peroksidase ditambahkan, dan pelat diinkubasi pada
suhu kamar selama 15-40 menit Serapan uji serum diukur pada 405 nm. Sampel uji
dianggap positif jika absorbansi sampel uji dalam sumur yang mengandung antigen
virus setidaknya dua kali absorbansi serum kontrol negatif dalam sumur yang
mengandung antigen virus dan setidaknya dua kali absorbansi sampel yang diuji
secara paralel dalam sumur yang mengandung antigen normal.
2.4. Netralisasi reduksi plaque
Tes
PRN sangat spesifik dan dapat digunakan untuk membedakan antara infeksi EEE dan
WEE. Uji PRN dilakukan dalam kultur embrio fibroblast bebek, Vero, atau BHK-21
dalam labu 25 cm2 atau enam lempeng sumur. Volume yang tercantum adalah untuk
botol; volume harus dibagi dua untuk sumur dalam plate enam-sumur. Sera dapat
disaring pada pengenceran akhir 1/10 dan 1/100. Titik akhir dapat ditentukan
dengan menggunakan tes PRN atau HI. Serum yang digunakan dalam uji PRN diuji
terhadap 100 unit pembentuk plak (PFU) virus (50 PFU untuk pelat enam sumur).
Campuran virus /serum diinkubasi pada 37 °C selama 75 menit sebelum diinokulasi
ke kultur sel monolayer konfluen dalam labu 25 cm2. Inokulum teradsorpsi selama
1 jam, diikuti dengan penambahan 6 ml media pelapis. Media overlay terdiri dari
dua larutan yang disiapkan secara terpisah. Larutan 1 mengandung 2 × Larutan Earle
garam Dasar tanpa fenol merah, 4% serum bovin janin, 100 μg /ml gentamisin, 200
µg /ml nystatin, 0,45% larutan natrium bikarbonat, dan 0,002% netral red.
Ketika embrio bebek fibroblast digunakan, Larutan 1 juga mengandung 6.6%
ekstrak ragi hidrolisat laktalbumin. Larutan II terdiri dari 2% Nobel Agar yang
disterilkan dan dipelihara pada 47 °C. Volume larutan I dan II yang sama
disesuaikan hingga 47 °C dan dicampur bersama sebelum digunakan. Uji diinkubasi
selama 48-72 jam, dan titik akhir didasarkan pada pengurangan 90% dalam jumlah plaques
dibandingkan dengan labu kontrol virus, yang seharusnya memiliki sekitar 100 plaques.
(2 =
RBCs dari angsa jantan putih domestik dewasa lebih disukai, tetapi RBC dari
angsa jantan lainnya dapat digunakan. Jika sel dari angsa betina digunakan,
mungkin ada lebih banyak variabilitas uji. Telah dilaporkan RBCs ayam jantan
menyebabkan penurunan sensitivitas tes).
(3 =
Tersedia dari: Pusat Pengendalian dan Pencegahan Penyakit, Reagen Referensi
Biologis, 1600 Clifton Road NE, Mail Stop C21, Atlanta, Georgia 30333, Amerika
Serikat).
C. PERSYARATAN UNTUK VAKSIN
1. Latar belakang
Vaksin
yang dilemahkan terhadap virus EEE dan WEE tersedia secara komersial. Vaksin
virus EEE dan WEE yang dilemahkan belum terbukti memuaskan. Vaksin yang
dilisensikan untuk digunakan di AS disiapkan dengan menggunakan kombinasi
berikut: EEE dan WEE; EEE, WEE, dan Venezuelan equine encephalomyelitis (VEE);
dan EEE dan VEE. Selain itu, tetanus toxoid, virus influenza yang tidak aktif,
dan virus West Nile yang tidak aktif telah dikombinasikan dengan EEE dan WEE
atau EEE, WEE, dan VEE. Vaksin saat ini dibuat dari virus yang diperbanyak
dalam kultur sel, dan diinaktivasi dengan formalin (Maire et al., 1970).
Pedoman
untuk produksi vaksin hewan diberikan dalam Bab 1.1.8 Prinsip produksi vaksin
hewan. Panduan yang diberikan di bawah dan dalam bab 1.1.8 dimaksudkan untuk yang
bersifat umum dan dapat dilengkapi dengan persyaratan nasional dan regional
2. Garis besar /Skema produksi dan
persyaratan minimum untuk vaksin
2.1 Karakteristik dari benih
Lihat
bab 1.1.8 untuk persyaratan umum untuk Benih Induk dan jalur yang diizinkan
untuk produksi vaksin. Benih yang sesuai harus dijaga pada –70 ° C dalam
keadaan terliofilisasi.
2.1.1. Karakteristik biologis dari
benih induk
Strain
standar virus EEE dan WEE diisolasi lebih dari 20 tahun yang lalu, telah
digunakan untuk produksi vaksin dan telah terbukti menghasilkan kekebalan
protektif. Strain virus EEE yang berbeda antigen dan dalam struktur molekul
telah diidentifikasi dari berbagai wilayah geografis. Namun, isolat Amerika
Utara dan Karibia tampaknya serupa (Weaver et al., 1994). Strain virus WEE yang
diisolasi dari berbagai negara telah ditemukan serupa baik dengan pengujian MAb
dan analisis sidik jari oligonukleotida RNA (Reisen & Monath, 1989). Suatu
isolat yang baru dikarakterisasi dengan baik dari negara tempat vaksin akan
digunakan akan menguntungkan. Virus yang dipilih harus imunogenik dan
bereplikasi ke titer yang tinggi dalam kultur sel.
2.1.2. Kriteria kualitas (Sterilitas,
kemurnia, bebas dari agen asing)
MSV
(Master Seed Virus) harus diuji untuk kemurnian, identitas, dan kebebasan dari
agen asing pada saat sebelum digunakan dalam pembuatan vaksin. MSV harus bebas
dari bakteri, jamur dan mycoplasma. MSV dikultur pada garis sel Vero dan jenis
sel embrio kuda dengan konfirmasi oleh teknik antibodi fluorescent untuk
menunjukkan terbebas dari equine herpesvirus, equine adenovirus, equine
arteritis virus, virus virus diare sapi, reovirus, dan agen asing virus rabies
MSV juga harus bebas dari virus asing dengan efek cytopathic (CPE) dan
haemadsorption pada kultur sel pada garis sel Vero dan jenis sel embrio kuda.
2.1.3. Validasi sebagai strain vaksin
Dalam
uji imunogenisitas, MSV pada tingkat lintasan tertinggi yang dimaksudkan untuk
produksi harus membuktikan keampuhannya (perlindungan) dalam vaksinasi marmut
/uji potensi serologi.
2.1.4. Prosedur darurat untuk
penerimaan secara profesional MSV dalam kasus epizootic (dengan patogen dengan
serotipe, misalnya virus bluetongue).
Dalam
situasi darurat epizootic, mungkin tidak cukup waktu untuk sepenuhnya menguji
MSV baru untuk semua agen asing; dalam situasi seperti itu, penerimaan
sementara dari strain baru dapat didasarkan pada analisis risiko kemungkinan
kontaminasi antigen yang dihasilkan dari MSV baru dengan agen asing. Penilaian
risiko ini harus mempertimbangkan karakteristik proses, termasuk sifat dan
konsentrasi inaktivator untuk vaksin yang tidak aktif, sebelum mengizinkan atau
tidak pelepasan awal produk baru.
2.2. Metode dari pabrikan
2.2.1. Prosedur
MSV
harus diperbanyak dalam garis sel yang dikenal untuk mendukung pertumbuhan EEE
dan WEE. Lihat bab 1.1.8 untuk panduan tambahan tentang persiapan dan pengujian
stok sel induk. Garis sel harus bebas dari virus asing, bakteri, jamur, dan
mycoplasma. Viral propagasi tidak boleh melebihi lima bagian dari MSV, kecuali
bacaan lebih lanjut membuktikan untuk menyediakan titer serologi yang cukup pada
marmut.
Garis
sel yang rentan disemai menjadi pembuluh yang sesuai. Media esensial minimal,
dilengkapi dengan fetal bovine serum (FBS), dapat digunakan sebagai media untuk
produksi. Inkubasi pada 37 °C.
Kultur
sel diinokulasi langsung dengan stok virus EEE dan WEE, yang umumnya 1 hingga 4
bagian dari MSV. Kultur yang diinokulasi diinkubasi selama 1-3 hari sebelum
panen media kultur. Selama inkubasi, kultur diamati setiap hari untuk CPE dan
kontaminasi bakteri.
Vaksin
yang dilemahkan dapat secara kimia diinaktivasi dengan formalin dan dicampur
dengan adjuvant yang sesuai. Durasi periode inaktivasi didasarkan pada kinetika
inaktivasi yang ditunjukkan.
Bahan
pengawet yang digunakan adalah thimerosal pada pengenceran 1/1000 dan
antibiotik (neomisin, polimiksin, amfoterisin B, dan gentamisin).
2.2.2. Persyaratan untuk bahan
Semua
bahan yang digunakan dalam pembuatan vaksin EEE dan WEE harus ditentukan dalam
protokol manufaktur yang disetujui dan konsisten dari batch ke batch. Lihat bab
1.1.8 untuk panduan umum tentang bahan-bahan asal hewan. Bahan-bahan asal hewan
harus bersumber dari negara dengan risiko yang dapat diabaikan untuk penyakit transmissible
spongiform encephalopathies (TSE).
2.2.3.
Kontrol saat Proses
Lot
lot produksi harus diperiksa setiap hari untuk perubahan sitopatik. Setelah
panen, suspensi virus harus diuji untuk keberadaan kontaminan mikroba. Lot lot
produksi harus dititrasi dalam kultur jaringan sebelum inaktivasi untuk
menstandarisasi produk. Lot titrasi rendah dapat terkonsentrasi atau tercampur
dengan banyak titrasi yang lebih tinggi untuk mencapai titer yang benar.
Lot
lot terinaktifasi harus diuji untuk kelengkapan inaktivasi pada anak anak ayam
umur 6 hingga 12 jam.
2.2.4. Uji bactch produk akhir
i) Sterilitas
Sampel
vaksin hidup dan diinaktifasi diperiksa mengenai kontaminasi bakteri dan jamur.
Volume media yang digunakan dalam uji ini harus cukup untuk meniadakan efek
bakteriostatik atau fungistatik dari pengawet dalam produk. Untuk menguji
bakteri, sepuluh bejana, masing-masing berisi minimal 120 ml media casein sari kedelai,
diinokulasi dengan 0,2 ml dari sepuluh sampel wadah akhir. Sepuluh bejana
diinkubasi pada 30–35 °C selama 14 hari dan diamati untuk pertumbuhan bakteri.
Untuk menguji jamur, sepuluh bejana, masing-masing berisi minimal 40 ml media
casein sari kedelai, diinokulasi dengan 0,2 ml dari sepuluh sampel wadah akhir.
Bejana diinkubasi pada 20–25 °C selama 14 hari dan diamati untuk pertumbuhan
jamur. Masing-masing negara mungkin memiliki persyaratan lain.
ii)
Identitas
Uji
batch terpisah untuk identitas harus dilakukan jika tes potensi batch, seperti
titrasi kultur jaringan dari vaksin virus hidup, tidak cukup memverifikasi
identitas agen dalam vaksin. Tes identitas mungkin termasuk tes fluorescent antibody
atau serum netralisasi.
iii)
Keamanan
Pengujian
keamanan batch untuk inaktivasi virus dilakukan pada anak ayam usia 6 hingga 12
jam. Sepuluh anak ayam diinokulasi secara subkutan dengan 0,5 ml produk dan
diamati setiap hari selama 10 hari. Jika reaksi tidak menguntungkan terjadi, batch
tidak dapat diterima.
iv)
Potensi batch
Uji
potensi dilakukan dengan menginokulasi masing-masing dari sepuluh kelinci
percobaan dengan stok vaksin virus EEE atau WEE, menggunakan setengah dosis
kuda pada dua kesempatan, 14–21 hari secara terpisah, dengan rute yang
direkomendasikan untuk kuda. Sampel serum dari masing-masing vaksinasi dan
setiap kontrol diuji 14-21 hari setelah dosis kedua menggunakan tes PRN. Titer
EEE harus ≥1 / 40, dan titer WEE harus ≥1 / 40 (Kode AS Peraturan Federal),
menggunakan sel Vero. Jika embrio fibroblas bebek digunakan dalam uji PRN,
titer akan lebih rendah. Tes potensi alternatif adalah dengan menggunakan
tantangan intracerebral, 14-21 hari setelah vaksinasi kedua. Setiap marmut
diinokulasi dengan 0,1 ml virus yang mengandung 100 LD50 (50% dosis mematikan).
Titrasi simultan dilakukan. Agar vaksin disetujui, 80% dari marmut harus
bertahan hidup dari kedua virus.
2.3. Persyaratan untuk otorisasi /
pendaftaran / pelisensian
2.3.1. Proses pemabrikan
(manufacturing)
Untuk
pendaftaran vaksin, semua perincian yang relevan mengenai pembuatan vaksin dan
pengujian kendali mutu (lihat Bagian C.2.1 dan C.2.2) harus diserahkan kepada
pihak berwenang. Informasi ini harus disediakan dari tiga batch vaksin
berturut-turut dengan volume tidak kurang dari 1/3 dari tipikal volume batch
industri.
Kontrol
dalam proses adalah bagian dari proses manufaktur.
2.3.2. Persyaratan keamanan
Formulasi
vaksin terinactivasi terakhir harus diuji dalam sejumlah terbatas hewan target
sebelum studi lapangan berskala lebih besar. Formulasi vaksin terakhir tidak
boleh menyebabkan reaksi yang merugikan.
Studi
keamanan lapangan harus dilakukan sebelum vaksin menerima persetujuan akhir.
Umumnya, dua seri harus digunakan, di tiga lokasi geografis yang berbeda dalam
kondisi peternakan yang khas, dan minimal 600 hewan. Vaksin harus diberikan
sesuai dengan rekomendasi label (termasuk dosis booster) dan harus mengandung
jumlah maksimum antigen virus yang diizinkan. (Jika tidak ada konten antigen
maksimum yang ditentukan, serial harus mengantisipasi potensi pasca pemasaran
yang khas.) Sekitar sepertiga dari hewan harus pada usia minimum yang
direkomendasikan untuk vaksinasi.
i)
Tindakan pencegahan (bahaya)
Vaksin
harus diidentifikasi sebagai tidak berbahaya atau patogen untuk vaksinator.
Produsen harus memberikan peringatan yang memadai bahwa saran medis harus
dicari dalam hal injeksi sendiri (termasuk untuk adjuvan, vaksin emulsi minyak,
pengawet, dll.) Dengan peringatan yang disertakan pada label produk /leaflet
sehingga vaccinator mengetahui adanya bahaya.
2.3.3. Persyaratan keefektifan
Untuk
mendaftarkan vaksin komersial, batch atau batch yang diproduksi sesuai dengan
metode standar dan mengandung jumlah minimum antigen atau nilai potensi akan
membuktikan keampuhannya (perlindungan) dalam uji coba vaksinasi / serologi
kelinci percobaan; setiap batch komersial masa depan harus diuji sebelum rilis
untuk memastikan memiliki nilai potensi yang sama ditunjukkan oleh batch (batch
batch) yang digunakan untuk uji (uji uji) kemanjuran.
2.3.4. Vaksin yang memungkinkan
strategi DIVA (Detection of Infection in Vaccinated Animals /deteksi infeksi
pada hewan yang divaksinasi)
Kuda
yang divaksinasi dapat mengembangkan titer serologis yang mana barangkali menghambat
kebolehan untuk mengekspor kuda.
2.3.5. Lamanya kekebalan
Studi
komprehensif tentang durasi kekebalan belum tersedia. Vaksinasi ulang tahunan
direkomendasikan untuk vaksin inaktif. Anak-anak kuda yang divaksinasi di bawah
usia 1 tahun harus divaksinasi sebelum musim vektor berikutnya.
2.3.6. Stabilitas
Vaksin
inaktivasi adalah stabil dan imunogenik selama 2 tahun jika disimpan dalam
lemari pendingin pada suhu 2–7 °C. Setelah 2 tahun, vaksin harus dibuang.
Penulis,
Disadur
oleh drh Giyono Trisnadi, Sumber: Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for
Terrestrial Animals OIE 2018.
*Catatan.
Bagi yang memerlukan TulIsan ini secara lengkap (beserta daftar pustakanya)
silakan menghubungi penulis dg email trisnadidrh@gmail.com
******
Tidak ada komentar:
Posting Komentar