Equine
viral arteritis adalah penyakit menular pada kuda yang disebabkan oleh virus dengan
tanda-tanda demam, depresi, edema skrotum dan preputium
(kuda jantan), konjungtivitis, edema supra atau periorbital,
rhinitis, ingusan, reaksi kulit urtikaria. Dan aborsi, lahir mati dan enteritis
atau pneumo-enteritis pada belo.
******
EQUINE VIRAL ARTERITIS
IKHTISAR
Equine viral arteritis
(EVA) adalah penyakit menular pada bangsa kuda yang disebabkan oleh virus: equine
arteritis virius (EAV), virus RNA yang tergolong dalam genus Arterivirus,
family Arteriviridae. Virus equine arteritis ditemukan pada populasi kuda di
banyak negara di seluruh dunia. Meski jarang dilaporkan di masa lalu,
dikonfirmasi wabah EVA tampaknya terus meningkat.
Deskripsi
penyakit: Mayoritas
infeksi yang didapat secara alami karena EAV bersifat subklinis. Jika ada,
tanda-tanda klinis EVA dapat bervariasi dalam kisaran dan tingkat keparahanya.
Penyakit ini terutama ditandai oleh demam, depresi, anoreksia, edema terutama
pada anggota badan, skrotum dan preputium kuda jantan, konjungtivitis, reaksi
kulit tipe urtikarial, aborsi dan jarang pneumonia fulminan, enteritis atau
pneumo-enteritis pada belo (anak kuda yang kecil). Terlepas dari angka kematian
pada belo, tingkat fatalitas kasus dalam wabah EVA sangat rendah. Kuda yang
terkena hampir selalu pulih secara klinis. Status karier jangka panjang dapat
terjadi dalam persentase yang bervariasi dari kuda jantan yang terinfeksi,
tetapi tidak pada kuda betina, kuda kebiri atau kuda jantan yg belum dewasa
kelamin
Identifikasi
agen: EVA tidak dapat
dibedakan secara klinis dari sejumlah penyakit kuda dan sistemik lainnya.
Diagnosis infeksi EAV bergantung pada laboratorium dan berdasarkan pada isolasi
virus, deteksi asam nukleat atau antigen virus, atau terlihatnya respons
antibodi spesifik. Deteksi dan identifikasi asam nukleat EAV pada kasus-kasus
tersangka penyakit ini dapat dicoba dengan menggunakan berbagai pengujian reverse-transcription
polymerase chain reaction (RT-PCR). Identitas isolat EAV harus dikonfirmasi
dengan uji RT-PCR, uji netralisasi, atau dengan metode imunositokimia, yaitu
imunofluoresensi tidak langsung atau teknik avidin-biotin-peroksidase.
Di mana kematian
dikaitkan dengan dugaan wabah EVA, berbagai jaringan harus diperiksa untuk
bukti histologis panvasculitis yang terutama di arteri kecil di seluruh tubuh.
Lesi vaskular yang khas terdapat pada hewan dewasa bukan ciri penting adanya
aborsi terkait EVA, diagnosis yang didasarkan pada isolasi virus, deteksi asam
nukleat virus oleh RT-PCR atau ditunjukkan oleh antigen EAV dengan pemeriksaan
imunohistokimia plasenta dan berbagai janin jaringan.
Tes
serologis: Berbagai
tes serologis, termasuk virus neutralisasi (VN), complement fixasi (CF),
indirect fluorescent antibody, agar gel immunodiffusion, enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA), dan fluorescent microsphere immunoassay assay
(MIA) telah digunakan untuk mendeteksi
antibodi terhadap EAV. Tes yang saat ini paling banyak digunakan adalah tes VN
pelengkap yang disempurnakan dan ELISA. Tes VN adalah tes yang sangat sensitif
dan sangat spesifik dari nilai yang terbukti dalam mendiagnosis infeksi akut
dan dalam studi seroprevalensi. Beberapa ELISA telah dikembangkan. Meskipun
tidak ada yang secara ekstensif divalidasi sebagai tes VN, beberapa menawarkan
spesifitas yang sebanding dan mendekati sensitivitas yang setara. Uji CF kurang
sensitif dari pada uji VN atau ELISA, tetapi dapat digunakan untuk mendiagnosis
infeksi baru.
Persyaratan
untuk vaksin: Dua
vaksin komersil saat ini tersedia untuk EVA. Salah satunya adalah vaksin virus
hidup modifikasi (MLV) yang dibuat dari virus yang telah dilemahkan untuk kuda
dengan beberapa transfer serial di sel-sel ginjal kuda dan kelinci primer dan
dalam garis sel (cell line) kulit kuda. Telah dipastikan aman dan protektif
untuk kuda jantan dan kuda betina yang tidak bunting. Vaksinasi belo kurang
dari 6 minggu usia dan kuda betina bunting dalam 2 bulan terakhir masa bunting
tidak dianjurkan. Tidak ada bukti pengembalian vaksin virus ke virulensi atau
rekombinasi dengan strain EAV yang terjadi secara alamiah berikut berguna di
lapangan. Vaksin kedua adalah produk yang tidak aktif (in aktif) dan adjuvanted
yang dibuat dari virus yang tumbuh dalam kultur sel kuda yang dapat digunakan
pada kuda bibik atau bukan bibit. Dengan tidak adanya data keamanan yang
sesuai, vaksin saat ini tidak direkomendasikan untuk digunakan pada kuda betina
bunting.
A. PENDAHULUAN
1.
Deskripsi penyakit dan etiologi
Equine viral arteritis
(EVA) adalah penyakit menular dari hewan bangsa kuda yang disebabkan oleh
virus: equine arteritis virus (EAV), virus single-stranded RNA, dan anggota prototipe dari genus
Arterivirus, family Arteriviridae, ordo Nidovirales (Cavanagh, 1997). Hanya
satu serotipe utama dari virus yang telah diidentifikasi sejauh ini. Epizootic
lymphangitis pinkeye, fièvre typhoide dan rotlaufseuche adalah beberapa istilah
deskriptif yang digunakan di masa lalu untuk merujuk pada penyakit yang mirip
secara klinis dekat dengan EVA. Rentang inang alami dari EAV akan tampak
terbatas pada kuda, meskipun bukti yang sangat terbatas mungkin juga termasuk unta,
alpaca dan llama (Weber et al., 2006). Virus tidak membahayakan bagi kesehatan
manusia (Timoney & McCollum, 1993).
Sementara sebagian
besar kasus infeksi akut dengan EAV adalah subklinis, strain tertentu dari
virus dapat menyebabkan penyakit dengan berbagai tingkat keparahan (Timoney
& McCollum, 1993). Kasus-kasus khas dari EVA dapat hadir dengan semua atau
kombinasi dari tanda-tanda klinis berikut: demam, depresi, anoreksia,
leukopenia, edema tergantung terutama dari anggota badan, skrotum dan preputium
dari kuda jantan, konjungtivitis, bloboken (tahi mata), edema supra atau
periorbital, rhinitis, ingusan, reaksi kulit urtikaria lokal atau umum, periode
subfertilitas sementara pada kuda jantan yang terkena akut, aborsi, lahir mati
dan jarang pneumonia fulminan, enteritis atau pneumo-enteritis pada belo.
Terlepas dari keparahan tanda-tanda klinis, kuda yang terkena hampir selalu pulih
secara baik. Tingkat fatalitas kasus dalam wabah EVA sangat rendah; mortalitas
biasanya hanya terlihat pada belo yang sangat muda, terutama mereka yang
terinfeksi virus secara kongenital (Timoney & McCollum, 1993; Vaala et al.,
1992), dan sangat jarang pada kuda dewasa yang sehat.
Sebuah persentase
variabel dari kuda-kuda terinfeksi akut kemudian menjadi karier (pembawa
penyakit) jangka panjang di saluran reproduksi dan penyemburan semen yang
konstan dari virus (Timoney & McCollum, 1993). Keadaan karier, yang telah
terbukti bergantung androgen, telah ditemukan di kuda jantan, tetapi tidak pada
kuda betina, kebiri atau kuda yang secara seksual belum dewasa (Timoney &
McCollum, 1993). Sementara dari regulasi kadar testosteron yang bersirkulasi
menggunakan antagonis GnRH atau dengan imunisasi dengan GnRH telah mempercepat
pembebasan dari status karier pada beberapa kuda, keampuhan dari strategi
pengobatan belum sepenuhnya ditetapkan. Perhatian telah dinyatakan bahwa
pendekatan terapeutik seperti itu dapat digunakan untuk secara sengaja menutupi
keberadaan penyakit pada status kuda karier.
Gambaran kasar dan
mikroskopik gejala menciri terjelaskan pada kasus EVA yang fatal mencerminkan
kerusakan vaskular yang luas yang disebabkan oleh virus (Del Piero, 2000). EAV
menyebabkan vaskulitis luas, terutama dari arteriol dan venula yang lebih
kecil. Hal ini menimbulkan edema, kongesti dan perdarahan, terutama di subkutis
dari tungkai dan perut, dan kelebihan cairan peritoneal, pleura dan perikardial
(Jones et al., 1957). Edema pulmonal, emfisema dan pneumonia interstitial,
enteritis dan infark limpa telah terjelaskan pada kasus EVA yang fatal pada belo
muda (Del Piero, 2000). Gambaran kasar lesi biasanya tidak ada dalam kasus
aborsi dan perubahan mikroskopis, dan jika ada paling sering terlihat pada
plasenta, hati, limpa dan paru-paru dan janin.
Faktor yang dianggap
penting dalam epidemiologi EVA adalah variasi fenotipik di antara strain virus,
cara penularan selama fase akut dan kronis infeksi, status karier dalam kuda
jantan, sifat dan durasi kekebalan yang didapat dan tren perubahan dalam
industri kuda. EAV hadir dalam populasi kuda di banyak negara di seluruh dunia
(Timoney & McCollum, 1993). Telah terjadi peningkatan kejadian EVA dalam
beberapa tahun terakhir yang telah dikaitkan dengan frekuensi yang lebih besar
dari pergerakan kuda dan penggunaan air mani yang diangkut (Balasuriya et al.,
1998). Transmisi EAV dapat terjadi melalui rute pernapasan, kelamin, dan
kongenital. Penyebaran melalui pernapasan paling penting selama fase infeksi akut.
EAV juga dapat ditularkan secara venereal oleh kuda yang terinfeksi akut atau
kuda betina dan oleh kuda jantan karier.
Program pengendalian
EVA saat ini ditujukan untuk mencegah penyebaran EAV dalam populasi pemuliaan
untuk meminimalkan risiko wabah aborsi, kematian pada belo dan pembentukan status
karier pada kuda muda dan kuda jantan (Timoney & McCollum, 1993).
Program-program tersebut didasarkan pada ketaatan praktik manajemen yang baik
dalam kaitannya dengan program vaksinasi yang ditargetkan untuk kuda jantan dan
kuda muda belum dewasa kelamin terhadap penyakit tersebut.
2.
Diagnosis banding
EVA tidak dapat
dibedakan secara klinis dari sejumlah penyakit kuda sistemik dan respirasi lainnya,
yang paling umum adalah equine influenza, ikfeksi equine herpesvirus 1 dan 4,
infeksi virus rinitis A dan B, equine adenoviruses dan infeksi streptokokus,
dengan referensi khusus. untuk purpura haemorrhagica. Penyakit ini juga
memiliki kesamaan klinis dengan equine anemia menular, infeksi virus
ensefalosis kuda, African horse sickness fever, kasus infeksi virus Hendra,
infeksi virus Getah dan toksikosis yang disebabkan oleh hoary alyssum (Berteroa
incana) (Timoney & McCollum, 1993).
B. TEKNIK DIAGNOSTIK
Tabel
1. Metode uji yang tersedia untuk diagnosis arteritis virus kuda dan tujuanya
|
Methode
|
Tujuan
|
||||||
|
Populasi bebas dari infeksi
|
Individua
hewan bebas dari infeksi
|
Efisiensi dari kebijakan eradikasi
|
Konfirmasi dari kasus
klinis
|
Prevalensi dari infeksi -
- surveillance
|
Status Immun pada
individu hewan atau populasi - setelah vaksinasi
|
||
|
|
Identifikasi
agen penyakit*1
|
||||||
|
Virus isolation
|
–
|
+++
|
–
|
+++
|
–
|
–
|
|
|
PCR
|
–
|
+++
|
–
|
+++
|
–
|
–
|
|
|
|
Deteksi respon immune
|
||||||
|
AGID
|
–
|
–
|
–
|
–
|
–
|
–
|
|
|
CFT
|
–
|
–
|
–
|
+++
|
–
|
–
|
|
|
ELISA
|
+
|
++
|
+
|
++
|
+++
|
+
|
|
|
VN
|
+
|
+++
|
+
|
+++
|
+++
|
+++
|
|
Kunci: +++ =
metode yang disarankan; ++ = metode yang cocok; + = dapat digunakan dalam
beberapa situasi, tetapi biaya, keandalan, atau faktor lain sangat membatasi
penerapannya; - = tidak sesuai untuk tujuan ini.
Meskipun
tidak semua tes yang terdaftar sebagai kategori +++ atau ++ telah mengalami
validasi formal, sifat rutin mereka dan fakta bahwa mereka telah digunakan secara
luas tanpa hasil yang meragukan, membuatnya dapat diterima.
PCR =
polymerase chain reaction; AGID = Agar gel immunodiffusion; CFT = Complement
fixation test; ELISA = enzyme-linked immunosorbent assay; VN = Virus neutralization
Deteksi dan identifikasi
untuk EAV adalah dari sampel klinis dan jaringan yang sesuai dapat dicapai
dengan isolasi virus dalam kultur sel dan dengan deteksi virus dari asam
nukleat menggunakan berbagai tes reverse-transcription polymerase chain
reaction (RT-PCR) assays. Kedua pendekatan diagnostik sesuai untuk konfirmasi
kasus klinis EVA serta membangun kebebasan individu dari infeksi EAV. Dalam
konteks yang terakhir, isolasi virus dan tes RT-PCR telah digunakan dalam
penelitian surveilans dan dalam memungkinkan pergerakan hewan terjadi. Deteksi
antigen melalui penggunaan berbagai teknik imunolabelling juga memiliki
aplikasi diagnostik ketika memeriksa jaringan dari kasus dugaan aborsi EVA,
kematian pada anak kuda muda atau kuda yang lebih tua.
Isolasi dari EAV dapat
dicoba dalam jumlah terbatas dari garis sel dimana garis sel ginjal kelinci RK-13
(ATCC CCL37, atau RK13-KY *2) telah terbukti optimal terutama ketika menguji
semen kuda jantan. Beberapa studi perbandingan yang komprehensif menunjukkan
isolasi virus memiliki sensitivitas yang setara dengan RT-PCR untuk mendeteksi
EAV pada bahan klinis dan morbid. Meskipun banyak isolasi virus dibuat dalam
bagian awal dalam kultur sel, isolasi virus bukanlah tes diagnostik cepat yang
bertentangan dengan tes RT-PCR tertentu yang dapat diselesaikan pada hari yang
sama.
Berbagai macam
pengujian RT-PCR (single step, nested, real-time) telah dikembangkan untuk
deteksi EAV. Sayangnya, sangat sedikit yang telah divalidasi secara memadai dan
dibandingkan dengan isolasi virus untuk sensitivitas dan spesifisitas. Penting
untuk ditekankan bahwa pilihan kit reagen untuk kedua asam nukleat dan
ekstraksi dan amplifikasi dalam pengujian real-time RT-PCR assay dapat memiliki
pengaruh besar pada keseluruhan sensitivitas diagnostik dan kekokohan pengujian
(Miszczak et al., 2011). ).
* 1 Kombinasi metode identifikasi agen
yang diterapkan pada sampel klinis yang sama direkomendasikan.
* 2 Tersedia dari Laboratorium
Referensi OIE untuk arteritis virus Equine di Amerika Serikat (AS) (lihat situs
web OIE untuk rincian kontak lengkap: http://www.oie.int
/en/our-scientific-expertise /reference-laboratories /list-of- laboratories/)
Pengujian
imunohistokimia untuk antigen EAV di potongan jaringan tetap atau beku paling
baik dilakukan dengan menggunakan serum poliklonal monospesifik terhadap virus
atau antibodi monoklonal (MAb) yang diarahkan terhadap protein virus
nukleokapsid (N) yang sangat tahan.
Dari uji serologis yang
dievaluasi untuk mendeteksi antibodi terhadap EAV, uji netralisasi virus yang
disempurnakan-komplemen (VN) telah terbukti paling dapat diandalkan untuk
diagnosis infeksi EAV akut dan untuk studi serosurveillance. Dari banyak uji
immunosorbent terkait enzim (ELISA) yang telah dikembangkan, beberapa
menawarkan sensitivitas dan spesifisitas yang sebanding tetapi tidak identik
dengan tes VN. Manfaat dari EAV ELISA adalah dapat memberikan hasil uji yang
sama dibandingkan dengan uji VN, yang merupakan uji 72 jam. Tak satu pun dari
uji yang tersedia dapat diandalkan membedakan titer antibodi yang dihasilkan
dari infeksi alami atau dari vaksinasi.
1.
Identifikasi agen
1.1.
Kultur in-vivo
Dalam hal terjadi
dugaan wabah EVA, atau ketika berusaha untuk mengkonfirmasi kasus infeksi EAV
subklinis, isolasi virus harus dicoba sebaiknya dari nasopharyngeal atau swab
hidung yang dalam, swab konjungtiva, sampel darah titik, dan air mani dari kuda
dianggap carier (Timoney & McCollum, 1993). Untuk mengoptimalkan peluang
isolasi virus selama wabah, spesimen yang relevan harus diperoleh sesegera
mungkin setelah timbulnya demam pada kuda yang terkena. Dalam percobaan isolasi
virus dari sel-sel mononuklear perifer (PBMC), darah harus dikumpulkan dalam
sitrat pada antikoagulan ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). Karena heparin
dapat menghambat pertumbuhan EAV pada sel-sel ginjal kelinci (sel line RK-13),
penggunaannya sebagai antikoagulan adalah kontra-indikasi karena dapat
mengganggu pengisolasian virus dari seluruh darah. Dimana EVA dicurigai dalam
kasus kematian pada belo muda atau hewan yang lebih tua, isolasi virus dapat
dicoba dari berbagai jaringan, terutama kelenjar limfatik yang terkait dengan
saluran pencernaan dan organ terkait, dan juga paru-paru, hati dan limpa
(McCollum et. al., 1971). Dalam wabah aborsi terkait EVA dan /atau kasus anak
kuda yang lahir mati, cairan plasenta dan janin dan berbagai jaringan plasenta,
lymphoreticular dan jaringan janin lainnya (terutama paru-paru) dapat menjadi
sumber produktif dari virus (Timoney & McCollum, 1993).
Swab untuk isolasi yang
dicoba harus direndam dalam media transport virus yang sesuai dan ini, bersama
dengan cairan atau jaringan yang dikumpulkan untuk isolasi virus dan /atau
pengujian RT-PCR harus dikirim dalam keadaan baik dingin atau beku dalam wadah
terisolasi ke laboratorium, idealnya dalam 24 jam. Jika swab dimaksudkan untuk
pemeriksaan langsung oleh RT-PCR, batang swab tidak boleh terbuat dari kayu,
yang mungkin mengandung zat seperti pengawet yang dapat mengganggu reaksi PCR.
Sampel darah tanpa sampel harus diangkut dalam lemari es tetapi tidak beku.
Bila memungkinkan, spesimen harus diserahkan ke laboratorium dengan kompetensi
yang ditetapkan dalam pengujian untuk infeksi ini.
Swab nasofaring pada
media transpor diproses dengan mentransfer masing-masing ke dalam syringe 10
ml, syringe plunger dimasukkan dan cairan apa pun yang dapat diekstraksi
dikumpulkan ke dalam tabung steril. Sebuah alikuot cairan dilewatkan melalui
prefilter dan kemudian disaring melalui fitter membran syringe 0,45 µm dan
dikumpulkan secara aseptik untuk inokulasi berikutnya ke dalam kultur sel.
Buffy coats dapat
dipanen dari darah tidak beku dengan sentrifugasi pada 600 g selama 15 menit,
dan lapisan buffy yang diambil setelah plasma telah dibuang dengan hati-hati.
Lapisan buffy kemudian dilapisi dengan larutan pemisah PBMC, Ficoll 1.077, dan
disentrifugasi pada 400 g selama 20 menit. PBMC interface (tanpa granulosit)
dicuci dua kali dalam saline buffer fosfat (300 g selama 10 menit) dan
disuspensikan kembali dalam 1 ml media Eagle’s minimal essential (MEM) yang
mengandung 2% FCS. Volume 0,5 ml suspensi sel yang dibilas ditambahkan ke
monolayer dari sel RK-13 dalam 25 cm2 termos atau pelat multiwall yang
ditambahkan media pemeliharaan.
Meskipun dilaporkan
tidak selalu berhasil dalam kasus-kasus alami dari infeksi EAV (Timoney &
McCollum, 1993), isolasi virus harus dicoba dari spesimen klinis atau jaringan
necropsy menggunakan kultur sel ginjal kelinci atu kuda (Timoney et al., 2004;
Timoney & McCollum, 1993). Jalur sel yang dipilih, mis. RK-13 (ATCC
CCL-37), LLC-MK2 (ATCC CCL-7), dan kultur sel ginjal kuda atau kelinci primer
dapat digunakan, dengan sel RK-13 menjadi sistem sel pilihan (Timoney et al.,
2004) ). Dari pengalaman selama bertahun-tahun menunjukkan bahwa isolasi utama
EAV dari air mani dapat menimbulkan lebih banyak kesulitan daripada spesimen
klinis lain atau dari jaringan yang terinfeksi kecuali sistem kultur sel yang
tepat digunakan. Beberapa faktor telah terbukti mempengaruhi isolasi primer EAV
dari air mani dalam sel RK-13. Tingkat isolasi yang lebih tinggi telah
diperoleh menggunakan 3 - 5 hari konfluen monolayers, ukuran inokulum besar
dalam kaitannya dengan luas permukaan sel dalam termos diinokulasi atau pelat
multiwell, dan yang paling penting, penggabungan karboksimetil selulosa
(viskositas sedang, 400–800 cps) dalam medium overlay. Perlu dicatat bahwa
sebagian besar sel RK-13, termasuk ATCC CCL-37, terkontaminasi dengan virus bovine
viral diarrhoea, kehadiranyalah yang tampaknya meningkatkan sensitivitas sistem
sel ini untuk isolasi utama EAV, terutama dari air mani. Dalam kasus spesimen
dari infektivitas viral rendah, tingkat isolasi EAV dapat ditingkatkan dengan
menggunakan sel RK-13 dari riwayat pasase yang tinggi *3 (Timoney et al.,
2004).
*3 Garis seperti itu (RK-13-KY) bisa
di dapat dari Laboratorium Referensi OIE untuk arteritis virus Equine di AS
(lihat situs web OIE untuk rincian kontak lengkap:http://www.oie.int /en
/our-scientific-expertise /reference-laboratories /list-of- laboratories/).
Kultur yang diinokulasi
diperiksa setiap hari untuk kemunculan efek sitopatik virus (CPE), yang
biasanya terbukti dalam 2–6 hari. Dengan tidak adanya CPE yang terlihat,
supernatan kultur harus di-subinoculasi ke sel confolent monolayers setelah 4-7
hari. Sementara sebagian besar isolasi EAV dibuat pada bagian pertama dalam kultur
sel, minoritas kecil hanya menjadi jelas pada bagian kedua atau selanjutnya
secara in vitro (Timoney & McCollum, 1993). Identitas isolat EAV dapat
dikonfirmasi dengan uji RT-PCR standar atau real-time (Balasuriya et al.,
1998), dalam uji netralisasi satu arah, atau dengan metode imunositokimia
(Little et al., 1995), indirect imunofluoresensi (Crawford & Henson, 1973)
atau teknik avidin-biotin-peroksidase (ABC) (Little et al., 1995). Antiserum
kelinci poliklonal telah digunakan untuk mengidentifikasi EAV dalam kultur sel
yang terinfeksi. Antibodi monoklonal tikus (MAbs) ke protein nukleokapsid (N)
dan glikoprotein amplop utama (GP5) dari EAV serta antiserum kelinci
monospesifik ke protein amplop unglycosylated (M) (Balasuriya et al., 1998)
juga telah dikembangkan dan ini dapat mendeteksi berbagai jenis virus dalam sel
RK-13 secepat 12-24 jam setelah infeksi (Balasuriya et al., 1998; Little et
al., 1995).
1.2.
Isolasi virus dari air mani (tes yang ditentukan untuk perdagangan
internasional)
Ada bukti yang cukup
kuat dalam jangka pendek dan panjang bahwa kuda jantan mengeluarkan EAV secara
konstan dalam air mani, tetapi tidak dalam sekresi pernafasan atau urin; tidak
juga telah ditunjukkan dalam buffy coat (sel mononuklear darah perifer) dari
hewan seperti itu (Timoney et al., 1987; Timoney & McCollum, 1993). Kuda
jantan harus diuji darah pertama kali dengan menggunakan tes VN atau ELISA yang
divalidasi dengan tepat atau prosedur uji serologis lainnya. Isolasi virus
harus dicoba dari air mani kuda-kuda serologis positif untuk antibodi terhadap
EAV misalnya titer VN ≥1 /4, yang tidak memiliki riwayat vaksinasi terhadap
EVA, juga dengan konfirmasi bahwa mereka serologis negatif (VN titer <1 /4)
pada saat vaksinasi awal. Isolasi virus juga diindikasikan dalam kasus air mani
yang dikirim di mana status serologi dan riwayat vaksinasi donor kuda mungkin
tidak tersedia. Disarankan agar isolasi virus dari semen dicoba dari dua
sampel, yang dapat dikumpulkan pada hari yang sama, pada hari berturut-turut,
atau setelah selang beberapa hari atau minggu. Tidak ada bukti bahwa hasil
percobaan isolasi virus dari kuda-kuda tertentu dipengaruhi oleh frekuensi
sampling, interval antar koleksi, atau waktu dalam setahun. Isolasi EAV harus
dilakukan lebih baik pada bagian dari seluruh ejakulasi yang dikumpulkan
menggunakan vagina buatan atau kondom dan teaser atau patung kuda betina.
Ketika tidak mungkin mendapatkan air mani dengan cara ini, alternatif yang
lebih disukai adalah mengumpulkan sampel turun pada saat pembiakan. Perawatan
harus diambil untuk memastikan bahwa tidak ada antiseptik /desinfektan yang
digunakan dalam pembersihan alat kelamin eksternal kuda sebelum pengumpulan.
Sampel harus mengandung fraksi yang kaya akan sperma dari ejakulasi yang
dengannya EAV dikaitkan karena virus tidak ada dalam fraksi sperma pra-sperma
(Timoney et al., 1987; Timoney & McCollum, 1993). Segera setelah
pengumpulan, semen harus didinginkan pada es atau pada kemasan freezer untuk
diangkut ke laboratorium sesegera mungkin. Jika ada kemungkinan keterlambatan
pengiriman spesimen untuk pengujian, air mani dapat dibekukan pada atau di
bawah –20 °C untuk jangka waktu singkat sebelum dikirim ke laboratorium.
Membekukan sampel tampaknya tidak mengganggu isolasi EAV dari air mani. Dalam
situasi di mana tidak mungkin untuk menentukan status carier kuda dengan
isolasi virus atau pengujian RT-PCR, kuda dapat diuji untuk dua kuda
seronegatif, yang diperiksa untuk seroconversi ke virus hingga 28 hari setelah
pembiakan ( Timoney & McCollum, 1993).
Adalah tidak mungkin
untuk menentukan secara pasti status karier kuda jantan yang diobati dengan
antagonis GnRH atau diimunisasi dengan GnRH untuk memodifikasi aktivitas atau
perilaku reproduksi, karena hal ini juga dapat mengganggu sheding EAV
sementara.
1.2.1.
Prosedur pengujian
i) Pada penerimaan di
laboratorium, harus dicatat apakah sampel semen dibekukan, didinginkan atau
pada suhu kamar. Setiap sampel harus diperiksa untuk memastikan bahwa itu
mengandung fraksi yang kaya akan sperma dari ejakulasi. Beberapa kuda jantan
dapat menghasilkan volume besar plasma seminal sebelum ejakulasi fraksi sperma
dan gel yang kaya sperma. Seringkali, fraksi pra-sperma ini mengandung sangat
sedikit sperma dan dapat menjadi negatif EAV meskipun kuda adalah pembawa EAV
(Timoney et al., 1987). Untuk mengoptimalkan deteksi virus, 50 μl setiap sampel
semen harus ditransfer ke slide kaca, ditutupi dengan penutup-slip dan
diperiksa secara mikroskopis pada pembesaran 100 untuk menilai kandungan
spermanya. Ejakulasi dengan kurang dari rata-rata lima sperma per sepuluh
bidang yang diperiksa harus dianggap nilai diagnostik yang dipertanyakan. Namun
perlu dicatat, bahwa kuda jantan oligospermia sesekali dapat positif EAV bahkan
dengan jumlah sperma yang rendah. Jika virus negatif di sisi lain, laporan
pengujian pada kuda tersebut harus menyertakan kualifikasi bahwa tidak adanya
EAV tidak dapat dijamin berdasarkan jumlah sperma rendah dalam sampel yang
diajukan. Selain itu, spesimen ejakulasi harus diperiksa secara visual dan
dicatat untuk warna dan adanya kontaminasi partikel kasar. Jika spesimen air
mani terkontaminasi dengan darah, yang dapat dihasilkan dari trauma pada kelamin
eksternal kuda pada saat pengumpulan, sampel yang berulang harus diminta untuk
menguji spesimen seperti dari kuda yang positif serologis dapat membahayakan
keandalan isolasi virus. hasil karena antibodi EAV dalam serum. Sangat jarang,
ejakulasi mungkin terlihat sedikit kekuningan karena kontaminasi dengan urin.
Sampel semacam itu mungkin positif untuk virus rinitis kuda.
ii) Meskipun tidak lagi
dianggap sebagai langkah penting, pretreatment air mani sebelum inokulasi ke
dalam kultur sel dengan sonication jangka pendek (tiga siklus 15 detik);
memfasilitasi pencampuran dan penyebaran sampel yang efektif.
iii) Setelah membuang
media kultur, kultur monolayer konfluen 3 - ke-5 hari dari sel RK-13, baik
dalam flask kultur jaringan 25 cm2 atau pelat multiwell, diinokulasi dengan
pengenceran seri desimal (dari 10–1 sampai 10–3). 3) plasma seminal dalam media
pemeliharaan kultur jaringan yang mengandung 2% serum janin bovin dan
antibiotik. Inokulum 1 ml per 25 cm2 flask digunakan dan tidak kurang dari dua
botol per pengenceran plasma seminal diinokulasi. Ukuran inokulum dan jumlah
well yang diinokulasi per pengenceran suatu spesimen harus dinilai di mana
pelat multiwell digunakan. Pengenceran yang tepat dari sampel semen kontrol
positif virus atau kontrol virus dari titer yang telah diencerkan dalam media
biakan harus dimasukkan dalam setiap uji.
iv) Flask ditutup,
tutup diganti pada piring multiwell dan kultur diinokulasi dengan lembut
diputar untuk menyebarkan inokulum ke sel monolayers.
v) Kultur diinokulasi
kemudian diinkubasi selama 1 jam pada 37 °C baik dalam inkubator aerobik atau
inkubator yang mengandung atmosfer yang dilembabkan dari 5% CO2 di udara,
tergantung pada apakah termos atau pelat multiwell digunakan.
vi) Tanpa menghilangkan
salah satu inokulum atau mencuci monolayer sel, yang terakhir dilapisi dengan
0,75% karboksimetil selulosa yang mengandung media dengan antibiotik.
vii) Flask atau pelat
diinkubasi ulang pada 37 °C dan diperiksa secara mikroskopis untuk virus CPE,
yang biasanya terbukti dalam 2–6 hari.
viii) Dengan tidak
adanya CPE yang terlihat, supernatan kultur disubinokulasi ke dalam kultur sel
monolayer sel confluent 3–5 hari dari sel RK-13 setelah 5-7 hari. Setelah
penghilangan media overlay, monolayers diwarnai dengan 0,1% larutan formalin-
buffer kristal violet.
Identitas setiap isolat
virus harus dikonfirmasi dengan RT-PCR standar atau real-time (Balasuriya et
al., 1998; Gilbert et al., 1997; Balasuriya et al., 2002; Lu et al., 2007;
Westcott dkk. ., 2003; Miszczak et al., 2011) oleh VN, immunofluorescence
(Crawford & Henson, 1973) atau teknik ABC, menggunakan antiserum
monospesifik untuk EAV atau MAbs ke protein struktural, N atau GP5 dari virus
(Balasuriya et al. , 1998; Del Piero, 2000; Little et al., 1995).
Dalam uji netralisasi
satu jalur, pengenceran serial dari isolat virus diuji terhadap penetralisir
MAb atau antiserum monospesifik yang dibuat melawan prototipe Bucyrus strain
EAV (ATCC VR 796) dan juga serum negatif untuk menetralisir antibodi terhadap
virus. Titrasi yang sesuai dari prototipe virus Bucyrus dengan reagen antibodi
referensi yang sama dimasukkan sebagai kontrol uji. Uji ini dilakukan baik
dalam labu kultur jaringan 25 cm2 atau pelat multiwell. Jumlah yang tepat dari
reagen antibodi positif dan negatif EAV yang diketahui tidak aktif selama 30
menit dalam penangas air pada suhu 56 °C dan diencerkan 1/4 dalam buffer salin
fosfat, pH 7,2; kemudian 0,3 ml reagen antibodi dilarutkan dibagikan ke dalam
lima tabung untuk setiap isolat yang akan diuji. Pengenceran sekuens serial
(dari 10–1 hingga 10–5) dari masing-masing isolat virus dibuat di dalam MEM's
Eagle yang mengandung 10% serum janin bovine, antibiotik dan 10% Cairan segar komplemen
marmut. Kemudian, 0,3 ml setiap pengenceran virus ditambahkan ke tabung yang
mengandung reagen antibodi positif dan negatif. Tabung digoyang dan campuran
virus /antibodi diinkubasi selama 1 jam pada 37 °C. Campuran kemudian
diinokulasi ke dalam kultur monolayer konfluen 3 - hingga 5 hari dari sel
RK-13, baik dalam labu 25 cm2 atau pelat multiwell, menggunakan dua botol atau
sumur per pengenceran virus. Setiap tabung diinokulasi dengan 0,25 ml campuran
virus /antibodi; ukuran inokulum pro-rata di mana piring multiwell digunakan.
Inokulasi termos atau pelat diinkubasi selama 2 jam pada 37 °C, goyang perlahan
setelah 1 jam untuk menyebarkan inokulum ke sel monolayers. Tanpa membuang
salah satu inokulum atau mencuci monolayer sel, yang terakhir dilapis dengan
0,75% karboksimetil selulosa yang mengandung media dan diinkubasi selama 4-5
hari pada 37 °C, baik dalam inkubator aerobik atau inkubator yang mengandung
atmosfer yang dilembabkan 5% CO2 di udara. Setelah pengangkatan medium,
monolayers diwarnai dengan 0,1% larutan kristal violet-buffered violet. Plak
dihitung dan titer infektivitas virus ditentukan baik di ada dan tidak adanya
antibodi EAV menggunakan metode Spearman-Kärber. Konfirmasi identitas isolat didasarkan
pada pengurangan jumlah plak setidaknya 102 log virus dengan adanya serum
positif antibodi terhadap strain Bucyrus dari EAV.
Mayoritas EAV isolat
dari kuda jantan karier dibuat dalam bagian pertama dalam kultur sel
menggunakan prosedur uji yang dijelaskan (Timoney & McCollum, 1993).
Terjadinya sitotoksisitas nonviral atau kontaminasi bakteri spesimen bukan
masalah yang signifikan ketika mencoba isolasi virus ini dari semen kuda.
Sitotoksisitas nonviral, jika diamati, biasanya mempengaruhi monolayers
diinokulasi dengan 10-1 dan, lebih jarang, pengenceran 10-2 dari plasma
seminal. Pengobatan plasma seminal dengan polietilen glikol (Mol. 6000) sebelum
inokulasi telah digunakan dengan beberapa keberhasilan dalam mengatasi masalah
ini (Fukunaga et al., 2000). Metode yang dijelaskan melibatkan penambahan
polietilena glikol ke 10–1 hingga 10-3 pengenceran plasma seminal untuk
memberikan konsentrasi akhir 10% dalam setiap pengenceran. Campuran diadakan
semalam pada 4 °C dengan pengadukan lembut, setelah itu disentrifugasi pada
2000 g selama 30 menit dan supernatan dibuang. Presipitat tersuspensi dalam
medium pemeliharaan kultur sel hingga sepersepuluh volume pengenceran asli dan
campurannya dihomogenisasi. Mereka kemudian disentrifugasi pada 2000 g selama
30 menit dan supernatan diambil dan digunakan untuk inokulasi. Tidak ada bukti
yang menunjukkan bahwa pretreatment plasma seminal dengan cara ini mengurangi
sensitivitas prosedur isolasi virus (Fukunaga et al., 2000). Jika kontaminasi
bakteri dari sampel adalah masalah, lebih baik untuk meminta pengumpulan semen
berulang dari kuda jantan individu. Jika ini tidak mungkin, upaya dapat
dilakukan untuk mengontrol kontaminasi dengan pra-perawatan sampel dengan
antibiotik yang mengandung media transpor virus, ditahan semalaman pada 4 °C
diikuti oleh ultrasentrifugasi dan resuspensi pelet sebelum pengenceran dan
inokulasi spesimen ke dalam kultur sel.
Ada dua laporan
kegagalan untuk mengisolasi EAV dari individu kuda jantan yang mana air mani
positif untuk asam nukleat virus pada uji RT-PCR. Setidaknya dalam satu kasus,
kegagalan untuk mendeteksi virus infeksi mungkin merupakan hasil dari aktivitas
penetralisir yang sangat tinggi dalam plasma mani kuda, menekankan nilai RT-PCR
sebagai tambahan untuk isolasi virus untuk mendeteksi EAV.
1.3.
Pendeteksian angtigen
Dimana kematian
dikaitkan dengan dugaan wabah EVA, berbagai jaringan harus diperiksa untuk
bukti histologis dari panvasculitis yang terutama ditunjukan di arteri kecil dan
venula di seluruh tubuh, terutama di sekum, usus besar, limpa, kelenjar
limfatik terkait dan korteks adrenal (Crawford & Henson, 1973; Del Piero,
2000; Jones et al., 1957). Kehadiran arteritis necrotik yang melibatkan sel-sel
endotelial dan medial dari pembuluh darah yang terkena dianggap sebagai ciri
patognomonik dari EVA. Lesi vaskular yang khas terlihat pada hewan dewasa atau tidak,
bagaimanapun, fitur yang menonjol dalam banyak kasus aborsi yang berhubungan
dengan EAV.
Antigen EAV dapat
diidentifikasi dalam berbagai jaringan hewan yang terkena EVA baik di terlihat
atau tidak adanya lesi (Del Piero, 2000). Antigen telah ditunjukkan pada
paru-paru, jantung, hati dan limpa dan plasenta janin yang diaborsi (Del Piero,
2000). Pemeriksaan imunohistokimia dari spesimen kulit yang dibiopsi juga telah
diteliti sebagai cara untuk mengkonfirmasikan infeksi EAV akut. Meskipun
beberapa nilai, itu tidak sepenuhnya dapat diandalkan untuk diagnosis penyakit.
Antigen virus dapat dideteksi di dalam sitoplasma sel yang terinfeksi oleh
immunofluorescence menggunakan serum polineun anti-EAV berkonjugasi
terkonjugasi (Crawford & Henson, 1973), atau dengan teknik ABC menggunakan
MAE tikus ke protein GP5 atau N dari virus (Del Piero, 2000).
1.4.
Metode molekuler
Standar dua langkah
RT-PCR, satu langkah RT-PCR, RT-nested PCR, dan real-time RT-PCR (rRT-PCR)
telah diterima secara luas sebagai alternatif atau tambahan untuk isolasi virus
dalam kultur sel untuk deteksi EAV dalam bahan diagnostik. Tes berbasis RT-PCR
menyediakan sarana untuk mengidentifikasi RNA spesifik virus dalam spesimen
klinis, yaitu nasofaring atau sekresi hidung, buffy coat, air mani segar maupun
awetan dan urin, dan dalam sampel jaringan pasmortem (Balasuriya et al., 2002;
Gilbert et al., 1997; Lu et al., 2007; Miszczak dkk., 2011; Westcott dkk.,
2003;). Standar, satu langkah RT-PCR, RT-nested PCR (RT-nPCR), dan satu tabung
TaqMan® rRT-PCR tes telah dikembangkan dan dievaluasi untuk mendeteksi berbagai
strain virus dalam cairan kultur jaringan, air mani dan sekresi hidung
(Balasuriya et al., 2002; Gilbert et al., 1997; Lu et al., 2007; Miszczak dkk.,
2011; Westcott dkk., 2003;). Uji ini menargetkan enam Frame pembacaan terbuka
(ORF) yang berbeda dalam genom EAV (ORFs 1b, 3–7). Namun, ada variasi yang
cukup besar dalam sensitivitas dan spesifisitas di antara pengujian RT-PCR yang
menggabungkan pasangan primer berbeda yang menargetkan berbagai ORF. Hasil yang
sebanding dengan isolasi virus telah diperoleh dengan beberapa tetapi tidak
semua langkah tunggal standar RT-PCR, dua langkah RT-PCR, RT-nPCR atau satu
tabung TaqMan® rRT-PCR assays (Balasuriya et al., 2002; Gilbert et al., 1997;
Lu et al., 2007; Miszczak et al., 2011). Dibandingkan dengan isolasi virus
tradisional, tes berbasis RT-PCR ini seringkali lebih sensitif dan jauh lebih
cepat untuk dilakukan, mayoritas membutuhkan waktu kurang dari 24 jam untuk menyelesaikannya.
Selain itu, uji RT-PCR memiliki keuntungan karena tidak membutuhkan virus yang
layak untuk kinerja uji. Uji satu rRT-PCR satu tabung untuk EAV menyediakan
metode yang sederhana, cepat dan andal untuk mendeteksi dan mengidentifikasi
asam nukleat virus dalam air mani kuda dan cairan kultur jaringan (Balasuriya
et al., 2002; Lu et al., 2007; Miszczak et al., 2011). Namun, ada bukti yang
menunjukkan bahwa pilihan kit komersial yang digunakan untuk ekstraksi asam
nukleat dan juga untuk amplifikasi dapat memiliki pengaruh besar pada
keseluruhan sensitivitas diagnostik dan ketahanan dari assay Miszczak et al.,
2011). Ini ditunjukkan dengan menggunakan metode ekstraksi asam nukleat
berbasis bead magnetik dalam kombinasi dengan kit RT-PCR komersial khusus. Satu
tabung rRT-PCR memiliki keuntungan penting di atas standar dua langkah RT-PCR:
1) menghilangkan kemungkinan kontaminasi silang antara sampel dengan produk
yang sebelumnya diperkuat karena tabung sampel tidak pernah dibuka; dan 2)
mengurangi kemungkinan reaksi positif palsu di mana produk rRT-PCR dideteksi
dengan probe urutan spesifik. Karena sensitivitas yang tinggi dari pengujian
RT-PCR, bagaimanapun, dan dengan tidak adanya perlindungan yang tepat di
laboratorium, ada potensi kontaminasi silang antara sampel, sehingga
menimbulkan hasil positif palsu. Sebagai contoh, pengujian RT-nPCR, sementara
itu memberikan sensitivitas yang ditingkatkan untuk mendeteksi EAV, itu juga
meningkatkan kemungkinan hasil positif palsu. Risiko kontaminasi silang lebih
besar menggunakan uji RT-nPCR karena langkah amplifikasi PCR kedua yang
melibatkan produk dari reaksi RT-PCR pertama. Untuk meminimalkan risiko
kontaminasi silang, perawatan yang cukup perlu dilakukan, terutama selama
langkah-langkah ekstraksi RNA dan pengaturan reaksi. Kontrol template EAV
positif dan negatif yang relevan dan, jika diperlukan, asam nukleat yang
diekstrak dari cairan kultur jaringan sel yang tidak terinfeksi, harus
dimasukkan dalam setiap pengujian RT-PCR. Dengan demikian, dalam sebagian besar
keadaan, penggunaan uji RT-PCR satu langkah atau satu tabung rRT-PCR akan
mengatasi masalah yang terkait dengan kontaminasi silang.
Pemilihan primer sangat
penting untuk kepekaan pengujian RT-PCR dengan primer (dan probe dalam kasus
uji rRT-PCR) sebaiknya dirancang dari wilayah konservasi dari genom EAV.
Analisis urutan nukleotida komparatif telah menunjukkan bahwa ORF 1b
(mengkodekan polimerase virus), ORF 6 (protein M) dan 7 (protein N) lebih bertahan
daripada ORF lainnya di antara strain EAV yang sejauh ini dianalisis dari
Amerika Utara dan Eropa (Balasuriya et al. ., 2002; Lu et al., 2007; Miszczak
et al., 2011; Westcott dkk., 2003). Gen yang paling lestari di antara berbagai
strain EAV adalah ORF7 dan primer khusus untuk ORF7 (dan probe untuk rRT-PCR)
telah mendeteksi keragaman strain virus asal Eropa dan Amerika Utara
(Balasuriya et al., 2002; Lu et al. ., 2007). Selanjutnya, penggunaan beberapa
pasangan primer spesifik untuk ORF berbeda 1b ([maju:
5'-GAT-GTC-TAT-GCT-CCA-TCA-TT-3 'dan sebaliknya: 5'-GGC-GTA-GGC-TCC-
AAT-TGA-A-3 ']) dan / atau [maju: 5'-CCT-GAG-ACA-CTG-AGT- CGC-GT-3' dan
sebaliknya 5'-CCT-GAT-GCC-ACA-TGG- AAT-GA-3 ']) (Gilbert et al., 1997), ORF 6
([ke depan: 5'-CTG-AGG-TAT-GGG-AGC-CAT-AG-3' dan sebaliknya: 5'-GCA-
GCC-AAA-AGC-ACA-AAA- GC-3 ']) dan ORF 7 ([ke depan
5'-ATG-GCG-TCA-AGA-CGA-TCA-CG-3' dan sebaliknya 5'-AGA-ATA-
TCC-ACG-TCT-TAC-GGC-3 ']) nyata meningkatkan kemungkinan mendeteksi strain EAV
Amerika Utara dan Eropa dalam pengujian RT-PCR. Dua pasangan primer spesifik
untuk ORF 1b cocok untuk digunakan dalam uji rRT-PCR (Gilbert et al., 1997).
Sementara RT-PCR telah ditemukan sangat sensitif untuk deteksi asam nukleat
virus dalam air mani segar, ada bukti bahwa itu tidak memiliki keandalan yang
setara ketika menguji semen kriopreservasi dari infektivitas virus yang sangat
rendah (Zhang et al., 2004).
Selain uji RT-PCR
sebelumnya, 2 TaqMan® pemeriksaan berdasarkan fluorogenic probe-tube rRT-PCR
telah dideskripsikan untuk mendeteksi asam nukleat EAV (Balasuriya et al.,
2002); primer ([ke depan: 5'-GGC-GAC-AGC-CTA-CAA-GCT-ACA-3 ', sebaliknya:
5'-CGG-CAT-CTG-CAG-TGA-GTG-A-3'] dan probe [
5'FAM-TTG-CGG-ACC-CGC-ATC-TGA-CCA-A-TAMRA-3 '] dan (Westcott dkk., 2003);
primer [ke depan: 5'-GTA-CAC-CGC-AGT- TGG-TAA-CA-3 ', sebaliknya:
5'-ACT-TCA-ACA-TGA-CGC- CAC-AC-3'] dan probe [5'FAM-TGG-TTC-ACT-CAC-TGC-AGA-
TGC-CGG-TAMRA-3 ']). Perlu dicatat, bagaimanapun, bahwa variasi genom di antara
bidang isolasi EAV dapat mengurangi sensitivitas tes RT-PCR dan rRT-PCR, bahkan
ketika primer dan probe didasarkan pada wilayah genom EAV yang paling lestari
(ORF 7). [Lu et al., 2007]). Studi filogenetik strain EAV dari daerah /negara
tertentu telah mengkonfirmasi keberadaan kelompok isolat yang lebih erat
terkait satu sama lain daripada ke strain virus latar belakang geografis yang
berbeda (Mankoc et al., 2007). Dalam keadaan seperti itu, primer yang
divalidasi selain yang sudah direkomendasikan mungkin lebih cocok untuk
mendeteksi strain EAV yang berbeda secara genom ini.
Dengan tidak adanya
kesepakatan yang luas tentang satu set primer universal untuk EAV, dan karena
tidak ada pengujian RT-PCR yang dapat menentukan infektivitas nyata sampel, ada
nilai untuk melakukan isolasi virus dalam hubungannya dengan RT-PCR atau
rRT-PCR untuk identifikasi virus dalam spesimen klinis atau post-mortem dan di
mana diindikasikan, analisis genomik dan fenotipik dari isolat virus.
Strain EAV yang
diisolasi dari berbagai daerah di dunia telah diklasifikasikan ke dalam kelompok
filogenetik berbeda dengan analisis urutan gen protein amplop GP3, GP5 dan M
(ORFs 3, 5 dan 6 masing-masing) dan gen protein nukleokapsid (N) (ORF 7).
[Balasuriya dkk., 1998; Zhang et al., 2010]). Gen GP5 telah ditemukan paling
bermanfaat dan dapat diandalkan untuk tujuan ini. Hubungan antara strain
ditunjukkan oleh sekuens nukleotida adalah alat epidemiologi molekuler yang
berguna untuk melacak asal-usul wabah EVA (Balasuriya et al., 1998; Zhang et
al.,
2010).
2.
Uji serologis
Berbagai tes serologis
telah diteliti untuk kemampuan mereka mendeteksi antibodi terhadap EAV. Ini
termasuk netralisasi (microneutralisation [Senne et al., 1985] dan pengurangan
plak [McCollum, 1970]), uji complement fixation (CF) (Fukunaga & McCollum,
1977), uji indirect fluorescent antibody (Crawford & Henson, 1973). ), agar
gel imunodifusi (Crawford & Henson, 1973), ELISA (Cho et al., 2000; Hedges
et al., 1998; Kondo et al., 1998; Nugent et al., 2000) dan fluorescent
microsphere immunoassay (MIA) (Go et al., 2008).
Menariknya, hanya satu
serotipe utama EAV yang diwakili oleh prototipe strain Bucyrus (ATCC VR 796)
telah diakui sejauh ini (McCollum, 1970; Timoney & McCollum, 1993).
Antiserum untuk EAV yang tidak mantap telah disiapkan dalam kuda dan kelinci
menggunakan protokol imunisasi konvensional. Tikus MAbs dan antibodi kelinci
monospesifik juga telah dikembangkan untuk protein nukleokapsid (N)
glikoprotein amplop utama (GP5), dan protein amplop unglycosylated (M) dari EAV
(Balasuriya et al., 1997).
2.1.
tes microneutralisation yang ditingkatkan
Microneutralisation
yang disempurnakan-komplemen saat ini adalah uji dalam penggunaan internasional
terluas untuk mendiagnosis infeksi EAV, melakukan studi seroprevalensi, dan
menguji kuda mengenai pergerakan. Ini juga telah digunakan untuk skrining darah
jantung fetus sebagai cara mendiagnosis retrospektif kasus aborsi terkait EVA.
Neutralizing antibodi untuk EAV bertahan selama beberapa tahun setelah infeksi
alami atau vaksinasi dengan vaksin hidup yang dimodifikasi terhadap EVA
(Timoney & McCollum, 1993).
2.2
Uji netralisasi virus (Uji yang ditentukan untuk perdagangan internasional)
Tes VN digunakan untuk
tujuan diagnostik untuk mengkonfirmasi infeksi pada kasus tersangka /wabah EVA
dan untuk menskrining kuda, misalnya kuda jantan, untuk bukti infeksi EAV.
Prosedur uji saat ini dalam penggunaan terluas adalah yang dikembangkan oleh
National Veterinary Service Laboratories dari Departemen Pertanian Amerika
Serikat (Senne et al., 1985). Sangat penting untuk mendapatkan sampel darah
steril karena kontaminasi bakteri serum dapat mengganggu hasil tes. Disarankan
bahwa tes dilakukan dalam sel RK-13 menggunakan strain CVL-Bucyrus
(Weybridge) dari EAV sebagai virus referensi *4 (Edwards et al., 1999).
Meskipun awalnya berasal dari prototipe virus Bucyrus, riwayat perjalanan
strain CVL (Weybridge) tidak sepenuhnya didokumentasikan. Stok virus referensi
ditanam di jalur sel RK-13, diklarifikasi dari puing-puing seluler dengan
sentrifugasi berkecepatan rendah dan disimpan dalam aliquot pada -70 ° C.
Beberapa alikuot beku dicairkan dan infektivitas virus stok ditentukan dengan
titrasi dalam sel RK-13. Sensitivitas tes VN untuk mendeteksi antibodi terhadap
EAV dapat dipengaruhi secara signifikan oleh beberapa faktor, terutama sumber
dan riwayat perjalanan strain virus yang digunakan (Edwards et al., 1999).
Strain CVL-Bucyrus (Weybridge) dan strain vaksin MLV yang sangat dilemahkan
dari EAV memiliki sensitivitas yang sebanding untuk mendeteksi sera positif
dengan titit rendah, terutama dari kuda yang divaksinasi EVA. Upaya terus untuk
membawa keseragaman yang lebih besar dalam protokol pengujian dan hasil
serologis di antara laboratorium yang menyediakan VN atau tes serologis lain
yang sebanding untuk infeksi ini. OIE Menyetujui Standard Sera untuk EAV
tersedia * 5 dan ini dapat memfasilitasi standarisasi internasional dari uji
microneutralisation dan ELISA.
*4 Tersedia dari Laboratorium
Referensi OIE untuk arteritis virus Equine di Inggris (lihat situs web OIE
untuk rincian kontak lengkap: http://www.oie.int / en / keahlian ilmiah-kami /
laboratorium-referensi / daftar -of-laboratorium /).
* 5 Tersedia dari Laboratorium
Referensi OIE untuk arteritis virus Equine di Amerika Serikat (AS) (lihat situs
web OIE untuk rincian kontak lengkap: http://www.oie.int / en / keahlian ilmiah
kami / referensi-laboratorium / daftar-laboratorium- /).
i) Sera diinaktivasi
selama 30 menit dalam penangas air pada suhu 56 ° C (kontrol sera, hanya
sekali).
ii) Pengenceran dua
kali lipat serum dari sera uji yang tidak aktif dalam media biakan sel bebas
serum (25 µl volumes) dibuat dalam piring mikrotiter grade sel yang rata-rata,
well-bottomed, dimulai pada pengenceran serum 1/2 dan menggunakan duplikasi
deretan sumur untuk setiap serum yang akan diuji. Kebanyakan sera disaring
awalnya pada pengenceran serum 1/4 dan 1/8 (yaitu pengenceran serum akhir
setelah penambahan volume yang sama dari pengenceran virus stok yang tepat
untuk setiap sumur). Sampel positif pada pengenceran 1/8 dapat, jika
diinginkan, diuji ulang dan dititrasi keluar untuk penentuan titik akhir.
Kontrol serum individu, bersama dengan serum kontrol positif rendah dan tinggi
yang telah diketahui juga harus dimasukkan dalam setiap uji.
iii) Pengenceran virus
stok yang terdiri dari 100 hingga 300 TCID50 (50% dosis infus kultur jaringan)
per 25 µL disiapkan menggunakan sebagai media biakan sel pengental, bebas serum
yang mengandung antibiotik dan larutan marmut atau kelinci segar pada
konsentrasi akhir 10%.
iv) 25 µl pengenceran
virus stok yang tepat ditambahkan ke setiap sumur yang mengandung 25 µl
masing-masing pengenceran serum, kecuali uji serum kontrol toksisitas dan sumur
kontrol sel pada masing-masing plat.
v) Sebuah titrasi balik
virus dari kerja pengenceran stok virus termasuk didalamnya, menggunakan empat
sumur per pengenceran sepuluh kali lipat, untuk mengkonfirmasi validitas hasil
tes.
vi) Plat ditutup dan
dikocok dengan lembut untuk memfasilitasi pencampuran campuran serum /campuran virus.
vii) Plat diinkubasi
selama 1 jam pada 37 °C dalam dengan kelembaban 5% CO2 di udara.
viii) Suspensi sel-sel
dari kultur sel RK-13 yang berumur 3 hingga 5 hari disiapkan menggunakan
konsentrasi yang akan memastikan monolayers konfluen di dalam cawan microtitre
dalam waktu 18-24 jam setelah seeding.
ix) 100 µl suspensi sel
ditambahkan ke setiap sumur, pelat ditutup dengan tutup pelat atau disegel
dengan pita dan dikocok dengan lembut.
x) Pelat diinkubasi
pada 37 °C dalam kelembaban 5% CO2 di udara.
xi) Pelat dibaca secara
mikroskopis untuk CPE nonviral setelah 12-18 jam dan lagi untuk CPE viral
setelah inkubasi 48-72 jam. Validitas tes dikonfirmasi dengan menetapkan bahwa
pengenceran kerja virus stok mengandung 30-300 TCID50 virus dan bahwa kontrol
serum positif berada dalam 0,3 log10 unit titer yang telah ditentukan.
Pengenceran serum
dianggap positif jika diperkirakan ada pengurangan 75% atau lebih besar dalam
jumlah CPE virus di dalam sumur uji serum dibandingkan dengan yang ada di dalam
sumur pengenceran kontrol virus terendah. Titik akhir kemudian dihitung
menggunakan metode Spearman – Kärber. Titer 1/4 atau lebih besar dianggap
positif. Serum negatif hanya harus memiliki jejak (kurang dari 25%) atau tidak
ada netralisasi virus pada pengenceran terendah yang diuji. Titer antibodi mungkin,
kadang-kadang, sulit untuk didefinisikan sebagai netralisasi parsial dapat
diamati pada berbagai pengenceran serum. Tidak jarang, sera akan dijumpai
sehingga menimbulkan perubahan toksik pada pengenceran yang lebih rendah yang
diuji. Dalam kasus seperti itu tidak mungkin untuk menentukan apakah sampel
negatif atau positif titrasi rendah. Masalahnya dapat diatasi dengan menguji
kembali sampel toksik menggunakan pelat mikrotiter dengan monolayers confluent
dari sel RK-13 yang telah diunggulkan pada hari sebelumnya. Juga, toksisitas
dalam sampel serum dapat dikurangi atau dihilangkan jika sampel teradsorpsi
dengan suspensi yang dikemas dari sel RK-13 sebelum pengujian atau dengan
mengganti kelinci sebagai ganti marmut dalam pelarut virus. Tampaknya ada lebih
dari satu jenis sitotoksisitas dalam serum. Status vaksinasi untuk equine
herpesvirus harus dipertimbangkan ketika mengevaluasi sera yang menyebabkan
sitotoksisitas non-viral. Salah satu vaksin equine herpesvirus saat ini
tersedia di Eropa telah terbukti merangsang antibodi untuk sel-sel ginjal
kelinci yang digunakan dalam produksi vaksin. Ini, pada gilirannya, dapat
menimbulkan sitotoksisitas, biasanya dalam 1/4 dan / atau 1/8 serum tetapi
kadang-kadang pada pengenceran yang lebih tinggi, dan menyebabkan kesulitan
dalam interpretasi hasil tes (Newton et al., 2004).
2.2.
Enzyme-linked Immunosorbent Assay
Sejumlah ELISAs
langsung atau tidak langsung telah dikembangkan untuk mendeteksi antibodi
terhadap EAV (Cho et al., 2000; Hedges et al., 1998; Kondo et al., 1998; Nugent
et al., 2000). Ini telah didasarkan pada penggunaan virus yang dimurnikan atau
antigen virus rekombinan yang diturunkan. Kegunaan uji sebelumnya dikompromikan
oleh frekuensi reaksi positif palsu. Yang terakhir dikaitkan dengan kehadiran
antibodi terhadap berbagai antigen kultur jaringan dalam serum kuda yang telah
divaksinasi dengan antigen yang berasal dari kultur jaringan. Identifikasi
pentingnya protein virus GP5 dalam stimulasi respon antibodi humoral terhadap
EAV mengarah pada pengembangan beberapa ELISA yang menggunakan sebagian, atau
seluruh protein rekombinan yang dihasilkan dalam sistem ekspresi bakteri atau
baculovirus (Cho et al., 2000; Hedges et al., 1998). Baru-baru ini, peptida
sintetis yang diikat ovalbumin yang mewakili asam amino 81-106 dari protein GP5
telah digunakan (Nugent et al., 2000). Beberapa uji ini tampaknya menawarkan
sensitivitas dan spesifisitas yang hampir sebanding dengan uji VN dan dapat
mendeteksi antibodi spesifik EAV sebelum reaksi positif didapat dalam tes VN.
Reaksi negatif palsu dapat terjadi, bagaimanapun, dengan beberapa uji ini.
Skrining acak peptida-fag dengan sera poliklonal dari kuda yang terinfeksi EAV
mengarah pada identifikasi ligan, yang dimurnikan dan digunakan sebagai antigen
dalam ELISA untuk EAV. Tidak ada korelasi yang ditemukan, namun, antara nilai
serap yang diperoleh dengan uji ini dan menetralisir titer antibodi,
menunjukkan bahwa antibodi yang dideteksi sebagian besar terhadap epitop
nonsurface virus. Sebuah ELISA berdasarkan pada penggunaan kombinasi protein
struktural GP5, M atau N dari EAV yang diekspresikan dari rekombinan
baculovirus berhasil mendeteksi antibodi virus pada kuda yang terinfeksi secara
alami atau eksperimental tetapi tidak pada hewan yang divaksinasi dengan EVA (Hedges
et al., 1998). Hal yang paling penting sehubungan dengan ELISA berbasis protein
GP5 untuk EAV adalah fakta bahwa sensitivitas uji akan bervariasi tergantung
pada urutan ektodomain (s) protein virus ini yang digunakan dalam pengujian.
Banyak variasi urutan asam amino dalam domain ini telah ditemukan di antara
isolat EAV. Untuk memaksimalkan sensitivitas ELISA berbasis GP5, mungkin perlu
menyertakan beberapa ectodomain sekuens perwakilan dari fenotipe yang diketahui
berbeda dari EAV dari pada bergantung pada urutan ektodomain tunggal. Dua
baru-baru ini menggambarkan ELISAs muncul untuk menawarkan paling menjanjikan
sebagai tes serodiagnostic yang dapat diandalkan untuk infeksi EAV (Cho et al.,
2000; Nugent et al., 2000). Pemblokiran ELISA yang melibatkan MAbs yang
diproduksi melawan protein GP5 dilaporkan memiliki sensitivitas 99,4% dan
spesifisitas 97,7% dibandingkan dengan uji VN (Cho et al., 2000). Uji lain, GP5
ovalbumin-konjugasi sintetis peptida ELISA terbukti memiliki sensitivitas dan
spesifisitas 96,75% dan 95,6%, masing-masing, menggunakan panel 400 VN serum
positif dan 400 VN sampel negatif (Nugent et al., 2000). Dari jumlah ELISA yang
telah dikembangkan (Cho et al., 2000; Hedges et al., 1998; Kondo dkk., 1998;
Nugent dkk., 2000), sedikit, jika ada, telah divalidasi secara luas sebagai tes
VN, meskipun beberapa akan muncul untuk menawarkan sensitivitas dan
spesifisitas yang hampir sebanding (Cho et al., 2000; Hedges et al., 1998;
Nugent et al., 2000). Perlu dicatat bahwa tidak seperti uji VN, reaksi positif
dalam ELISA tidak selalu mencerminkan status kekebalan protektif kuda individu
ke EAV baik sebagai antibodi yang tidak menetralisir dan penetralisir yang
terlibat.
2.3
Uji Complement fixation
Tes CF telah digunakan
di masa lalu, untuk mendiagnosis infeksi baru-baru ini dengan EAV berdasarkan
fakta bahwa antibodi pengikat komplemen relatif berumur pendek durasinya
(Fukunaga & McCollum, 1977). Tes ini telah sangat banyak digantikan oleh
tes VN dan ELISA yang berbeda untuk melakukan studi serosurveillance dan
menguji perpidahan kuda.
2.4.
Fluorescent-microsphere immunoassay
Sebuah fluorescent-MIA
telah dikembangkan untuk mendeteksi antibodi kuda ke protein struktural utama
dari EAV (Go et al., 2008). Itu didasarkan pada kloning dan mengekspresikan protein
mayor individu yang penuh-panjang, (GP5, M, N), serta urutan parsial dari
setiap protein struktural dan termasuk ini dalam uji terpisah. Imunisasi yang
berbeda dianalisis dengan instrumen Luminex. Uji protein berbasis GP5 parsial
memberikan hasil terbaik, dengan sensitivitas dan spesifisitas masing-masing
92,6% dan 93,9%, dibandingkan dengan uji VN.
C. PERSYARATAN UNTUK VAKSIN
1.
Latar belakang
Sejumlah vaksin
eksperimental dan komersial telah dikembangkan terhadap EVA. Saat ini, ada dua
vaksin komersial yang tersedia, baik yang berasal dari kultur jaringan. Yang
pertama adalah vaksin virus hidup yang dimodifikasi (MLV) dan yang kedua adalah
vaksin adjuvanated inactivated (vaksin inaktif dengan adjuvan). Vaksin MLV
tersedia secara komersial di AS dan Kanada. Ini juga telah digunakan di bawah
kendali menteri di Argentina dan di Selandia Baru. Vaksin yang inaktif ini
dilisensikan untuk penggunaan komersial di negara-negara Eropa tertentu,
termasuk Denmark, Prancis, Jerman, Hungaria, Irlandia, Swedia dan Inggris.
Indikasi untuk menggunakan vaksin ini adalah untuk mencegah wabah EVA, termasuk
aborsi pada kuda betina bunting dan penetapan negara karier untuk kuda jantan.
Karena kuda jantan karier (pembawa penyakit) dianggap sebagai reservoir utama
EAV, pengurangan populasi pembawa dari waktu ke waktu akan menghasilkan kontrol
yang lebih besar atas EVA dan akhirnya dapat berkontribusi untuk pemberantasan
penyakit di negara-negara tertentu. Vaksin MLV disiapkan dari virus yang telah
dilemahkan untuk kuda dengan beberapa transfer serial di sel-sel kuda dan
kelinci primer dan dalam garis sel (cell line) kulit kuda (Doll et al., 1968;
McCollum, 1970). Vaksin ini dilisensikan untuk digunakan pada kuda jantan, kuda
yang tidak bunting dan bukan bibit. Sedangkan kuda yang bukan bibit dapat
divaksinasi setiap saat, kuda jantan dan kuda betina harus divaksinasi tidak
kurang dari 3 minggu sebelum berkembang biak. Vaksin ini tidak direkomendasikan
untuk digunakan pada kuda betina bunting, terutama dalam 2 bulan terakhir kebuntingan,
atau anak kuda di bawah usia 6 minggu kecuali dalam menghadapi risiko
signifikan terkena infeksi alami.
Vaksin komersial kedua
yang tersedia untuk melawan EVA adalah produk yang tidak aktif (in aktif) yang
dibuat dari virus yang ditanam dalam kultur sel kuda, yang disaring, secara
kimia tidak aktif dan kemudian dikombinasikan dengan adjuvan yang dapat
dimetabolisme. Vaksin ini dilisensikan untuk digunakan pada kuda yang bukan
bibit dan bibit. Dengan tidak adanya data keamanan yang sesuai, vaksin saat ini
tidak direkomendasikan untuk digunakan pada kuda betina bunting.
Vaksin inaktivasi
tambahan terhadap EVA telah dikembangkan di Jepang dan disimpan dalam
penyimpanan untuk distribusi jika wabah EVA terjadi di negara tersebut. Ini
adalah vaksin ber-formalin-inaktivasi cair yang telah terbukti aman dan efektif
untuk digunakan pada kuda yang bukan bibit dan bibit. Untuk imunisasi yang optimal dengan
vaksin ini, kuda memerlukan program primer dari dua suntikan yang diberikan
pada selang waktu 4 minggu, dengan dosis booster diberikan setiap 6-12 bulan.
Karena vaksin tidak tersedia secara komersial, tidak ada rincian yang dapat
diberikan pada produksinya.
2.
Catatan dari produksi dan persyaratan minimum untuk faccine
2.1.
Karakteristik benih
Baik MLV maupun vaksin
komersial yang tidak aktif berasal dari prototipe Bucyrus strain EAV (ATCC VR
796), varian eksperimental dari isolat paru janin yang ditemukan selama wabah
penyakit pernapasan dan aborsi yang luas di dekat Bucyrus, Ohio, AS, pada tahun
1953 ( Doll et al., 1957). Bukti yang ada menunjukkan adanya hanya satu
serotipe utama virus, dan variasi strain tidak dianggap signifikan dalam
kaitannya dengan keberhasilan vaksin (McCollum, 1970; Timoney & McCollum, 1993).
2.1.1.
Karakteristik biologis dari benih induk
Dalam kasus vaksin MLV,
virus prototipe (ATCC VR 796) dilemahkan oleh bagian serial dalam pasase kultur
utama ginjal kuda (HK-131), ginjal kelinci (RK-111), dan garis sel kulit kuda
diploid, ATCC CCL57 (ECID-24) (Doll et al., 1968; McCollum, 1970). Indikasi
dari penggunaan vaksin ini adalah bahwa virus tersebut aman dan imunogenik
antara jalur ke-80 dan ke-111 dalam sel-sel ginjal kelinci primer (Doll et al.,
1968; McCollum, 1970).
Vaksin adjuvan inaktivasi
disiapkan dari prototipe strain Bucyrus EAV (ATCC VR 796) yang telah dipatenkan
yang telah dimurnikan plaknya dan dalam bagian serial keempatnya dalam sel line
kulit kuda diploid (ECID-4). Setelah pertumbuhan dalam kultur sel, virus
kemudian dimurnikan dengan penyaringan sebelum secara kimia diinaktifasi dan diadjuvani.
Virus untuk kedua MLV
dan vaksin inaktif harus ditanam dalam sistem kultur sel yang stabil, seperti
sel-sel kulit kuda, menggunakan media yang sesuai yang dilengkapi dengan serum sapi
steril atau serum albumin sapi sebagai pengganti serum sapi dalam media
pertumbuhan. Sel monolayers harus dicuci sebelum inokulasi virus untuk
menghilangkan jejak serum sapi. Pertumbuhan virus yang luas sebagaimana
dibuktikan oleh munculnya perubahan sitopatik pada 80-100% sel harus diperoleh
dalam 2-3 hari. Banyak virus induk benih (master seed) untuk setiap vaksin
dipertahankan dalam nitrogen cair atau yang setara.
2.1.2.
Kriteria kualitas (Sterilitas, kemurnian, terbebasnya dari agen asing)
Tes untuk steriitas,
kemurnian dan kebebasan vaksin dari kontaminasi dengan agen asing dapat dilihat
di Bab 1.1.9 Tests of biological materials
for sterility and freedom from contamination.
2.1.3.
Validasi sebagai strain vaksin
Dalam kasus dua vaksin
vaksin MLV dan inaktif, strain virus masing-masing harus ditanam dalam sistem
kultur sel yang tepat yang telah secara resmi disetujui untuk produksi vaksin
dan dikonfirmasi untuk terbebas dari agen asing, bakteri, jamur, mycoplasmas
dan virus (Moore, 1986). . Identitas virus vaksin dalam benih induk (master
seed) harus dikonfirmasi dengan netralisasi dengan serum anti-EAV yang homolog.
Netralisasi tidak lengkap EAV oleh anti sera kuda homolog atau kelinci telah
didokumentasikan secara ilmiah (Moore, 1986; Senne et al., 1985) dan merupakan
masalah ketika skrining master seed virus untuk virus asing dan ketika mencoba
untuk mengkonfirmasi identitas virus vaksin. Masalahnya telah dihindari dengan
mengurangi titer infektivitas virus master seed di bawah yang diperlukan untuk
produksi virus benih (seed) sebelum melakukan uji netralisasi pada virus yang
diencerkan. Campuran virus /serum diuji untuk residu virus aktif oleh bagian
serial dalam kultur sel. Tidak ada bukti virus cytopathic, virus haemadsorbing,
atau strain virus bovine diare yang non-setopatik yang harus ditemukan,
berdasarkan percobaan isolasi virus dalam kultur sel. Jika sel asal kuda
digunakan, mereka harus dikonfirmasi untuk bebas dari virus infeksi anemi kuda.
Teknologi konvensional seperti PCR dan ELISAs penangkapan-antigen sekarang
lebih biasa digunakan dari pada isolasi virus dalam penyaringan untuk agen-agen
adventif.
2.2.
Metode pembuatan
2.2.1.
Posedure
Kedua vaksin MLV dan
inaktivasi diproduksi oleh pembiakan virus benih (seed) masing-masing dalam
sistem sel kulit kuda. Sel monolayers harus dicuci sebelum inokulasi dengan
virus benih (seed) untuk menghilangkan jejak serum bovin dalam media
pertumbuhan. Kultur yang diinokulasi harus dipelihara pada media pemeliharaan
yang tepat. Pemanenan kultur yang terinfeksi harus terjadi ketika hampir
seluruh lembar sel menunjukkan CPE yang khas. Cairan dan sel-sel supernatan
dipanen dan diklarifikasi dari debris seluler dan bahan yang tidak diinginkan
dengan penyaringan. Dalam kasus vaksin inaktif, virus yang dimurnikan kemudian diinaktifasi
secara kimia dan di adjuvan dengan adjuvan yang dapat dimetabolisme. Pengawet
yang ditambahkan ke MLV dan vaksin yang tidak aktif adalah neomisin, polimikin
B dan amfoterisin B.
2.2.2.
Persyaratan untuk bahan
Lihat Bab 1.1.8 Principles
of veterinary vaccine production, the focus of which is on products of
biological origin of negligible risk.
2.2.3.
Kontrol untuk proses
MLV dan vaksin yang
tidak aktif harus diproduksi dalam garis sel (cell line) yang stabil yang telah
diuji identitasnya dan dikonfirmasi untuk bebas dari kontaminasi oleh bakteri,
jamur, mikoplasma atau agen adventif lainnya. Selain pengujian praproduksi dari
virus benih induk (master seed) untuk setiap vaksin dan garis sel (cell line) untuk
kontaminan adventif, kultur sel yang terinfeksi virus vaksin masing-masing
harus diperiksa secara makroskopis untuk bukti pertumbuhan mikroba atau
kontaminasi asing lainnya selama masa inkubasi. Jika pertumbuhan dalam kultur bejana
tidak dapat ditentukan secara andal dengan pemeriksaan visual, subkultur,
pemeriksaan mikroskopis, atau keduanya harus dilakukan.
2.2.4.
Uji batch produk akhir
i) Sterilitas
Tes untuk kemandulan
dan kebebasan dari kontaminasi bahan biologis dapat ditemukan di bab 1.1.9. In
the case of both MLV and inactivated vaccines, each production lot of
vaccine should be
checked for extraneous
bacterial, fungal and
mycoplasmal contaminants.
ii) Keamanan
Vaksin harus diuji
keamanannya dengan inokulasi intramuskular setidaknya dua kuda seronegatif
untuk menetralkan antibodi ke EAV dengan satu dosis vaksin virus lyophilised
masing-masing (Moore, 1986). Tak satu pun dari kuda yang diinokulasi harus menunjukkan
tanda-tanda klinis penyakit selain demam ringan selama periode observasi 2
minggu berikutnya. Reaksi lokal sementara dapat diamati pada kurang dari 10%
kuda yang diinokulasi dengan vaksin. Selain itu, swab nasofaring harus
dikumpulkan setiap hari dari setiap kuda untuk isolasi virus yang dilakukan;
jumlah sel darah putih dan suhu tubuh juga harus diperiksa setiap hari. Tidak
ada perubahan febril atau hematologis yang signifikan yang harus dilakukan
setelah vaksinasi (Timoney & McCollum, 1993). Penumpahan (sheeding) virus
vaksin yang terbatas dari rute pernapasan dan pada air mani dapat ditunjukkan
pada kuda sesekali dalam 7 hari pertama setelah vaksinasi. Tidak ada bukti
adanya persistensi virus vaksin di dalam saluran reproduksi kuda jantan yang
divaksinasi (Timoney & McCollum, 1993).
Untuk memastikan
inaktivasi lengkap dari virus vaksin, setiap serial vaksin inaktif harus
diperiksa untuk virus yang layak oleh tiga bagian serial dalam sel kulit kuda
dan dengan pewarnaan antibodi fluoresen langsung dengan konjugat EAV spesifik
sebelum digabungkan dengan adjuvant. Ini harus diikuti dengan uji keamanan pada
marmut dan tikus.
iii) Potensi batch
Potensi vaksin dalam
wadah akhir ditentukan oleh uji infektivitas plak dalam kultur monolayer sel
kulit kuda dan dengan uji tantangan vaksinasi pada kuda (Moore, 1986). Vaksin
harus diuji dalam rangkap tiga dalam kultur sel, titer infektivitas yang
dimaksud dihitung dan laju dosis ditentukan atas dasar bahwa setiap dosis
vaksin harus mengandung tidak kurang dari 3 × 104 unit pembentuk plak dari EAV
yang dilemahkan. Potensi in-vivo dari MLV dan vaksin yang tidak aktif
dievaluasi dalam uji tantangan vaksinasi tunggal menggunakan 17-20 kuda kontrol
yang divaksinasi dan 5-7 atau dalam dua uji masing-masing terdiri dari sepuluh
vaksin dan lima kontrol. Konsentrasi antigen virus dalam vaksin yang tidak
aktif lebih dari seribu kali konsentrasi antigen virus yang ada dalam vaksin
MLV.
2.3.
Persyaratan untuk otorisasi /pendaftaran /lisensi
2.3.1.
Proses manufaktur
Untuk pendaftaran
vaksin, semua perincian terkait pembuatan bagian vaksin dan kontrol kualitas
harus diserahkan kepada pihak berwenang. Informasi ini harus disediakan dari
tiga batch berturut-turut dengan volume tidak kurang dari 1/3 dari volume batch
industri yang umum.
2.3.1.
Persyaratan keamanan
Produsen MLV
merekomendasikan satu dosis vaksin yang diberikan secara intramuskular untuk
vaksinasi primer diikuti dengan vaksinasi ulang tahunan. Vaksinasi yang
disarankan untuk vaksin inaktif, yang juga harus diberikan oleh rute
intramuskular, adalah program utama dari dua vaksinasi 3-6 minggu terpisah,
diikuti dengan vaksinasi ulang setiap 6 bulan.
i) Keamanan hewan target
dan non-target
Vaksin MLV dianggap
aman untuk kuda jantan dan kuda betina tidak bunting. Tidak ada bukti yang
menunjukkan bahwa virus vaksin dapat membentuk status karier dalam kuda jantan
yang divaksinasi. Vaksin MLV tidak direkomendasikan untuk digunakan pada kuda
betina hamil atau anak kuda kurang dari 6 minggu. Meskipun kontra-indikasi dinyatakan
oleh produsen, vaksin ini telah digunakan pada kuda betina hamil di dua
trimester pertama tanpa gejala sisa yang merugikan. Ada risiko aborsi pada kuda
yang divaksinasi dalam dua bulan terakhir kehamilan. Vaksin inaktif aman untuk
digunakan pada hewan bukan indukan dan indukan. Dengan tidak adanya data
keamanan yang sesuai, vaksin saat ini tidak direkomendasikan untuk digunakan
pada kuda yang sedang buntig.
ii) Pemulihan virulensi
untuk vaksin hidup yang dilemahkan dan pertimbangan lingkungan
Baik studi lapangan
eksperimental dan luas yang dilakukan sejak vaksin MLV pertama kali dirilis
secara komersial pada tahun 1985, telah gagal memberikan bukti balik kembali ke
virulensi atau rekombinasi dengan strain EAV yang terjadi secara alami (Timoney
& McCollum, 1993).
iii) Tindakan
pencegahan
Pabrikan vaksin dua
vaksin MLV dan inactive menyediakan
informasi yang memadai di sisipkan di masing-masing vaksin untuk penggunaan
yang disarankan dari masing-masing vaksin, termasuk kontraindikasi tertentu
dalam kasus vaksin MLV. Tidak ada vaksin yang berbahaya bagi vaksinator.
2.3.3.
Persyaratan keefektifan
Ke dua vaksin MLV dan
inaktif telah dievaluasi untuk kemanjuran dalam vaksinasi - studi tantangan.
Ini melibatkan tantangan pernafasan dari sekelompok kuda yang divaksinasi
pertama kali 4 minggu setelah imunisasi primer, dengan prototipe virulen
Bucyrus strain EAV. Tingkat kekebalan protektif yang ditimbulkan oleh vaksinasi
dinilai berdasarkan kegagalan untuk menghasilkan tanda-tanda klinis EVA pada
kuda yang ditantang atau penurunan yang signifikan dalam tingkat keparahan
penyakit dibandingkan dengan yang diamati pada kontrol yang tidak divaksinasi.
Kemanjuran vaksinasi dalam mencegah pembentukan status karier pada kuda jantan
yang divaksinasi juga sama dievaluasi.
2.3.4.
Durasi kekebalan
Titer antibodi
penetralisir yang terdeteksi untuk EAV harus berkembang di sebagian besar kuda
dalam 1-2 minggu vaksinasi dengan vaksin MLV (Timoney & McCollum, 1993).
Tanggapan yang dilaporkan untuk vaksinasi primer bervariasi dalam beberapa
penelitian. Dalam satu studi vaksinasi kuda jantan, ada penurunan cepat titer
antibodi dengan sejumlah besar hewan yang kembali ke seronegatifitas 1–3 bulan
setelah vaksinasi. Di sisi lain, penelitian lain telah dicirikan oleh respon
tahan lama yang sangat baik, dengan persistensi tingkat VN yang tinggi untuk setidaknya
1-2 tahun. Vaksinasi ulang dengan vaksin ini menghasilkan respons anamnesa yang
sangat baik, dengan perkembangan titer antibodi tinggi yang relatif tidak
berkurang selama beberapa tahun (Timoney & McCollum, 1993).
Studi eksperimental
telah menunjukkan bahwa sebagian besar kuda yang divaksinasi dengan vaksin yang
tidak aktif mengembangkan titer antibodi penetralitas rendah hingga sedang
untuk EAV pada hari ke 14 setelah vaksinasi kedua. Tidak ada informasi yang
dipublikasikan tentang durasi kekebalan yang diberikan oleh vaksin ini.
2.3.5.
Stabilitas
Vaksin MLV
terliofilisasi dapat disimpan setidaknya selama 3-4 tahun pada 2-7 ° C tanpa
kehilangan infektivitas, asalkan disimpan dalam gelap. Infeksi dipertahankan
untuk waktu yang lebih lama jika vaksin dibekukan pada -20 °C atau di bawahnya.
Setelah rehidrasi, bagaimanapun, vaksin harus digunakan dalam waktu 1 jam atau
dihancurkan. Vaksin yang tidak aktif disimpan sebagai suspensi cair pada 2-8 °C,
tanpa kehilangan potensi setidaknya selama 1 tahun, asalkan itu terlindungi
dari cahaya.
Penulis,
Disadur
oleh drh Giyono Trisnadi, dari Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for
Terrestrial Animals OIE 2018 yang berjudul EQUINE INFECTIOUS ANAEMIA.
*Catatan,
bagi yang memerlukan Tulisan secara lengkap (asli beserta daftar pustakanya)
silakan mengubungi penulis dg email trisnadidrh@gmail.com
******
Tidak ada komentar:
Posting Komentar