Deskripsi
penyakit: Equine influenza adalah infeksi saluran pernafasan akut pada kuda,
keledai, bagal dan zebra yang disebabkan oleh dua subtipe yang berbeda (H7N7,
sebelumnya equi-1, dan H3N8, sebelumnya equi-2) dari virus influenza A dalam
genus lnfluenzavirus A dari keluarga Orthomyxoviridae. Virus dari subtipe H7N7
belum terisolasi sejak akhir 1970-an.
Virus equine influenza dari kedua subtipe
dianggap berasal dari burung dan yang sangat pathogen H5N1 telah dikaitkan
dengan wabah penyakit pernapasan pada keledai di Mesir. Pada equidae yang
sangat rentan, tanda-tanda klinis termasuk demam dan batuk kering yang keras
diikuti dengan keluarnya cairan hidung mukopurulen. Terutama pada hewan
divaksinasi yang kebal, satu atau lebih dari tanda-tanda ini mungkin tidak ada.
Kuda yang terinfeksi divaksinasi masih bisa mengeluarkan virus dan berfungsi
sebagai sumber virus untuk kelompok mereka. Karakteristik, influenza menyebar
dengan cepat pada populasi yang rentan. Penyakit ini endemik di banyak negara
dengan populasi kuda yang banyak. Dalam beberapa tahun terakhir, infeksi telah
masuk ke Australia dan masuk kembali ke Afrika Selatan dan Jepang; saat ini
Selandia Baru dan Islandia dilaporkan bebas dari virus influenza kuda.
Sementara
yang biasanya terbatas pada equidae, equine influenza H3N8 telah menyeberangi
penghalang spesies ke anjing. Perluasan infeksi pada anjing telah dilaporkan di
Amerika Utara di mana ia biasanya menimbulkan demam ringan dan batuk tetapi
dapat menyebabkan pneumonia yang fatal. Sementara equine influenza belum
terbukti menyebabkan penyakit pada manusia, bukti serologis infeksi telah
dijelaskan terutama pada individu dengan pajanan virus. Selama 2004-2006 pengawasan
influenza di Cina Tengah (RRC) dua virus equine influenza H3N8 juga terisolasi
dari babi.
Identifikasi
agen: telur ayam berembrio dan /atau kultur sel dapat digunakan untuk isolasi
virus dari swab nasofaring atau hidung dan trakea wash. Isolat seharusnya
selalu segera dikirim ke Laboratorium Referensi OIE. Infeksi juga dapat
ditunjukkan dengan deteksi virus asam nukleat atau antigen dalam sekresi
pernapasan menggunakan uji reverse-transcription polymerase chain reaction
(RT-PCR) atau uji antigen-capture enzyme-linked immunosorbent assay
(ELISA), berturut turut.
Tes
serologis: Diagnosa infeksi virus influenza biasanya hanya dilakukan dengan uji
pada sera berpasangan; sampel pertama harus diambil sesegera mungkin setelah
timbulnya gejala klinis dan kedua sekitar 2 minggu kemudian. tingkat antibodi
ditentukan oleh uji haemagglutination inhibition (HI) atau uji single radial
haemolysis (SRH).
Persyaratan
untuk vaksin: Sebaran infeksi dan keparahan penyakit dapat dikurangi dengan
penggunaan vaksin influenza yang potensial yang mengandung strain virus yang
relevan secara epidemiologi. Vaksin influenza kuda inaktif berisi seluruh virus
atau subunit mereka. Virus vaksin yang diperbanyak dalam telur ayam berembrio
atau kultur jaringan, terkonsentrasi, dan dimurnikan sebelum inaktivasi dengan
agen seperti formalin atau beta-propiolactone. Vaksin inaktif memberikan
perlindungan dengan menginduksi antibodi humoral ke protein hemaglutinin.
Respon umumnya berumur pendek dan dosis berlipat diperlukan untuk mempertahankan
tingkat perlindungan dari antibodi. Ajuvan biasanya diperlukan untuk merangsang
tingkat pelindung tahan lama dari antibodi. Virus hidup yang dilemahkan dan
vaksin vektor virus telah mendapat lisensi di beberapa negara.
Vaksin
rusak telah dikaitkan dengan potensi vaksin yang tidak memadai, vaksinasi
jadwal yang tidak tepat, dan virus vaksin usang yang dikompromikan sebagai
akibat dari antigenic drift. Sebuah uji potensi in-vitro (single difusi radial)
dapat digunakan untuk pemrosesan pengujian kandungan antigenic dari produk yang
dilemahkan sebelum penambahan ajuvan. Dalam proses uji hidup dan vector.
Vaksin
bergantung pada titrasi infeksi virus. Program surveilance internasional
memantau antigenic drift antara virus influenza kuda, dan setiap tahun Ahli
Surveillance Panel (ESP) untuk Equine Influenza membuat rekomendasi untuk
strain vaksin yang sesuai. Mengikuti perubahan rekomendasi, vaksin harus
diperbarui secepat mungkin untuk memastikan perlindungan yang optimal. Hal ini
sangat penting untuk populasi kuda yang sangat mobil dan untuk setiap kuda yang
dalam perjalanan internasional.
A.
PENDAHULUAN
Equine
influenza disebabkan oleh dua subtipe: H7N7 (sebelumnya subtipe 1) dan H3N8
(sebelumnya subtipe 2) virus influenza A (genus Influenza virus A dari keluarga
Orthomyxoviridae); namun telah ada sedikit sekali laporan dari infeksi virus
subtipe H7N7 dalam 30 tahun terakhir (Webster, 1993).
Pada
equidae yang sepenuhnya rentan, tanda-tanda klinis termasuk demam, leleran
hidung dan batuk kering yang keras; pneumonia pada anak kuda muda dan keledai
dan ensefalitis pada kuda telah digambarkan sebagai peristiwa langka (Daly et
al, 2006;. Gerber, 1970). Tanda-tanda klinis yang berhubungan dengan infeksi
pada anjing juga termasuk demam dan batuk; kadang-kadang hasil infeksi pada
bronkopneumonia supuratif dan kematian peracute (Crawford et al., 2005).
Karakteristik, influenza menyebar dengan cepat pada populasi yang rentan. Virus
ini menyebar melalui rute pernapasan, dan secara tidak langsung oleh personel
yang terkontaminasi, kendaraan dan material. Masa inkubasi pada kuda rentan
mungkin kurang dari 24 jam. Terutama pada hewan divaksinasi yang kebal masa
inkubasi dapat lebih lama, satu atau lebih tanda-tanda klinis mungkin tidak ada
dan penyebaran penyakit mungkin terbatas. Hal ini membuat diagnosis klinis
equine influenza lebih sulit karena penyakit virus lainnya, seperti penyakit
equine herpes virus terkait pernapasan, mungkin secara klinis menyerupai bentuk
ringan dari influenza. Kuda yang terinfeksi dengan virus influenza kuda menjadi
rentan terhadap infeksi bakteri sekunder dan dapat memunculkan leleran hidung
mukopurulen, yang dapat menyebabkan terdiagnosa penyakit bakteri dengan
penyebab yang diabaikan.
Virus
equine influenza diyakini berasal dari burung, dan belakangan lebih menularkan
dari virus avian ke kuda dan keledai telah dicatat. Analisis urutan virus H3N8
diisolasi pada tahun 1989 dari kuda selama epidemi influenza terbatas di timur
laut China (RRC) menetapkan bahwa virus itu lebih erat terkait dengan virus flu
burung dari virus influenza kuda (Guo et al., 1992). Avian H5N1 telah dikaitkan
dengan penyakit pernapasan dari keledai di Mesir (Abdel-Moneim et al., 2010).
Virus
equine influenza memiliki potensi untuk menyeberang hambatan spesies dan telah
dihubungkan dengan penyakit pernapasan pada anjing terutama di Amerika Utara
(Crawford et al., 2005). Wabah yang terisolasi dari equine influenza juga
terjadi pada anjing di Inggris tetapi virus belum menjadi menetap pada populasi
anjing. Berhubungan dekat dengan kuda yang terinfeksi diduga penyebab dalam
setiap wabah di Inggris. virus influenza kuda juga telah diisolasi dari babi di
China tengah (RRC) (Tu et al., 2009). Meskipun identifikasi tidak berkala pada
orang seropositif karena paparan ketika kerja saat ini terdapat sedikit bukti
infeksi zoonosis pada manusia oleh equine influenza (Alexander & Brown,
2000).
Di
negara-negara endemik kerugian ekonomi akibat equine influenza dapat
diminimalkan dengan vaksinasi dan banyak otoritas pacuan dan Asosiasi berkuda
memiliki kebijakan wajib vaksinasi. Vaksinasi tidak menghasilkan imunitas
steril; kuda divaksinasi bisa menumpahkan virus dan berkontribusi diam-diam
terhadap penyebaran penyakit. strategi manajemen risiko yang tepat untuk
menangani kemungkinan ini harus dikembangkan.
B.
TEKNIK DIAGNOSTIKA
Metode
pengujian yang tersedia untuk diagnosa equine influenza dan tujuannya dirangkum
dalam Tabel 1. Diagnosa laboratorium infeksi virus equine influenza akut
didasarkan pada deteksi virus di swab hidung dikumpulkan dari kuda dengan
penyakit pernapasan akut. Atau, demonstrasi respon serologis terhadap infeksi
dapat dicoba dengan sampel serum berpasangan. Idealnya, kedua metode yang
digunakan. virus equine influenza dapat diisolasi pada telur ayam berembrio
'atau kultur sel. Infeksi juga dapat ditunjukkan dengan deteksi antigen virus
dalam sekresi pernapasan menggunakan uji antigen capture enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA) atau dari genom virus menggunakan uji
reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) assays. Semua virus
influenza sangat menular untuk hospes rentan dan perawatan harus dilakukan
sejak penanganan telur yang terinfeksi atau kultur untuk menghindari kecelakaan
kontaminasi silang. Strain standar tidak boleh disebarkan di laboratorium
diagnostik, setidaknya tidak pernah pada saat yang sama atau di tempat yang
sama di mana sampel diagnostik sedang diproses. Semua wilayah kerja harus
didesinfeksi secara efisien sebelum dan sesudah manipulasi virus, yang
sebaiknya dilakukan dalam contaiment biohazard level 2 dan kelas II safety cabinet.
Adalah
penting untuk mendapatkan sampel sesegera mungkin setelah timbulnya gejala
klinis, sebaiknya dalam 3 -5 hari. Sampel ini termasuk swab nasofaring dan
hidung atau trakeal washing, yang terakhir diambil mengunakan endoskopi. Swab
dapat terdiri dari penyerap kapas spons /kain kasa, dan harus cukup panjang
untuk dilewatkan melalui meatus ventral ke nasofaring. Swab harus dipindahkan
ke tabung yang berisi media transport segera setelah digunakan. Media ini
terdiri dari fosfat buffered saline (PBS) yang mengandung baik 40% gliserol
atau 2% kaldu tryptose fosfat dengan 2% larutan antibiotik (penisilin [10.000
unit], streptomycin [10.000 unit] dalam air suling steril [100 ml]), dan 2%
Fungizone (250 mg /ml stok). Jika sampel akan diinokulasi dalam waktu 1-2 hari
mereka dapat ditempatkan pada 4 °C, namun, jika disimpan lebih lama, mereka
harus disimpan pada -70 °C atau kurang. Sampel harus tetap dingin ketika
ditransportasikan ke laboratorium.
Pengolahan
sampel harus mengikuti prosedur mutu diuraikan dalam Bab 1.1.5 Manajemen mutu
di laboratorium pengujian hewan, mengambil langkah-langkah untuk mencegah
kontaminasi silang. Cairan dikeluarkan dari kapas dengan meremas dengan tang
dan swab tersebut kemudian dibuang ditempatnya. Antibiotik kemudian dapat ditambahkan
jika sampel tampaknya sangat terkontaminasi dengan bakteri. Sisa cairan
disimpan pada suhu -70 ° C. Sampel yang dibubuhi antibiotik dapat ditaruh di
atas es selama 30-60 menit dan kemudian disentrifugasi pada 1500 g selama 15
menit untuk menghilangkan bakteri dan kotoran; cairan supernatan digunakan
untuk inokulasi. Sisa cairan disimpan pada suhu -70 °C. Filtrasi sampel tidak
disarankan karena virus influenza dapat terserap ke filter dan hilang dari
sampel.
Table
1. Metode pengujian yang ada untuk mendiagnosa equine influenza
Methode
|
Tujuan
|
||||||
Populasi bebas
dari infeksi
|
Individu hewan bebas dari infeksi sebelum pindah
|
Kontribusi untuk kebijakan eradikasi
|
Konfirmasi dari kasus klinis
|
Prevalensi dari infeksi - Surveilen
|
Status imun pada individu
hewan atau populasi setelah vaksinasi
|
||
Agent identifikasi1
|
|||||||
Isolasi
virus
|
-
|
+
|
-
|
++
|
-
|
-
|
|
Real time
RT-PCR
|
-
|
+++
|
+++
|
+++
|
+++
|
-
|
|
RAD
|
-
|
+
|
-
|
++
|
+
|
-
|
|
Antigen-capture
ELISA
|
-
|
++
|
++
|
+++
|
++
|
-
|
|
Deteksi respon immune
|
|||||||
HI
|
++
|
++a
|
-
|
+++a
|
+++
|
++
|
|
SRH
|
++
|
+a
|
-
|
+++a
|
+++
|
+++
|
|
ELISA
|
+
|
-
|
+b
|
+a
|
+
|
+
|
|
Kunci:
+++ = metode yang direkomendasikan; ++ = Metode yang cocok; + = Mungkin
digunakan dalam beberapa situasi, tetapi biaya, kehandalan, atau faktor-faktor
lain sangat membatasi penerapannya; - = Tidak sesuai untuk tujuan ini.
Meskipun
tidak semua tes terdaftar sebagai kategori +++ atau ++ telah menjalani validasi
formal, sifat rutin mereka dan fakta bahwa mereka telah digunakan secara luas
tanpa hasil yang meragukan, membuat mereka diterima.
RT-PCR
= reverse-transcription polymerase chain reaction; RAD = rapid antigen
detection;
HI
= haemagglutination inhibition; SRH = single radial haemolysis; ELISA =
enzyme-linked immunosorbent assay.
ªUji
sampel berpasangan diperlukan;
ᵇBarangkali
berguna untuk DIVA (detection of infection in vaccinated animals) bila
digunakan dengan vaksin yang tepat.
________________
1
Kombinasi metode identifikasi agen diterapkan pada sampel klinis yang sama
adalah dianjurkan.
1.
Identifikasi agen
Isolasi
virus menular dapat dilakukan pada telur ayam berembrio 'atau kultur sel. Secara
tradisional, telur telah disukai untuk isolasi equine influenza sebanyak isolat
klinis yang tidak tumbuh dengan baik dalam sel tanpa pasase berlanjut.
Perbandingan virus H3N8 yang diisolasi dalam telur dan sel Madin-Darby canine
kidney/ginjal (MDCK) menunjukkan bahwa sel-sel MDCK mampu memilih varian virus
yang tidak mewakili virus predominan di spesimen klinis (Ilobi et al., 1994).
Namun, beberapa virus telah berhasil diisolasi di sel MDCK tapi tidak dalam
telur dan pemilihan varian juga terjadi sebagai akibat dari kultur pada telur
(Oxburgh & Klingborn, 1999). Idealnya, isolasi harus dicoba menggunakan
kedua substrat.
RT-PCR
dan uji real-time RT-PCR menjadi uji yang secara luas digunakan di laboratorium
diagnostik sebagai alternatif yang lebih sensitif terhadap isolasi virus
(Quinlivan et al., 2005). Antigen virus influenza di sekret hidung juga dapat
dideteksi secara langsung oleh antigen-capture ELISA yang sensitif untuk virus
H3N8 menggunakan antibodi monoklonal (MAb) terhadap virus equine influenza
nukleoprotein (Livesay et al., 1993). Pengujian ini tidak tersedia secara
komersial, selain sebagai layanan diagnostik, namun kit komersial mandiri untuk
mendeteksi influenza manusia yang tersedia telah terbukti untuk mendeteksi
antigen influenza equine (Chambers et al, 1994; Yamanaka et al, 2008).
Pendekatan ini kurang sensitif dibandingkan RT-PCR tapi memberikan hasil yang
cepat di mana keputusan manajemen sebagai dasarnya. Ini tidak boleh digunakan
untuk mengesampingkan isolasi virus. Adalah penting bahwa virus baru diisolasi
dan dikirim ke laboratorium rujukan untuk karakterisasi sebagai bagian dari
program pengawasan untuk memantau antigenic drift dan munculnya virus baru dan
untuk menyediakan isolat untuk update vaksin. Positif RT-PCR dan ELISA hasilnya
berguna dalam pemilihan sampel untuk upaya isolasi virus jika sumber daya
terbatas, atau pemilihan spesimen untuk dikirim ke laboratorium rujukan untuk
isolasi virus dan karakterisasi.
1.1.
Isolasi virus dalam telur ayam berembryo
Telur
fertil diset dalam inkubator lembab di 37-38 °C dan dibalik dua kali sehari;
setelah 10-11 hari, mereka diperiksa dengan candling dan telur berembryo hidup
yang dipilih untuk digunakan. Daerah di atas kantung udara dibersihkan dengan
alkohol dan lubang kecil dibuat melalui shell. Inokulum dapat dimasukkan ke
dalam amnion atau rongga allantois. Beberapa telur /sampel diinokulasi (0,1 ml)
di rongga amnion tanpa pengenceran tambahan sampel (sampel juga dapat
diencerkan 1/10 dan 1/100 dalam PBS yang mengandung antibiotik). Jarum suntik
ditarik sekitar 1 cm dan selanjutnya 0,1 ml disuntikkan ke dalam rongga
allantois. Sebagai alternatif, banyak laboratorium memilih untuk menyuntik ke
dalam rongga allantois saja melalui lubang kedua dibor tepat di bawah garis
kantung udara. Lubang (s) disegel dengan lilin atau selotip, dan telur
diinkubasi pada 34-35 °C selama 3 hari. Embrio yang mati dalam waktu 24 jam
inokulasi berikut harus dibuang. Telur yang mengandung embrio yang mati lebih
dari 24 jam setelah inokulasi atau mengandung embrio hidup setelah 3 hari
diperiksa untuk menunjukkan virus equine influenza.
Telur
ditempatka ke suhu 4 °C selama 4 jam atau semalam untuk membunuh embrio dan
mengurangi perdarahan pada saat panen. Kerabang didesinfeksi, dan amnion dan
/atau cairan allantois dipanen dengan pipet, setiap panen disimpan terpisah.
Ini diuji untuk haemagglutination (HA) aktivitas dengan mencampurkan
pengenceran dua kali lipat dari cairan yang dipanen dalam volume yang sama
(0,025 ml) dengan sel darah merah ayam (red blood cells = RBCs) (0,5% [v/v] sel
dikemas dalam PBS) di plate mikrotiter dasar V atau U atau 0,4% sel darah merah
hamster -RBCs (0,4% [v/v] paket sel dalam PBS) di pada plat dasar V atau
piring. Pelat diinkubasi selama kurang lebih 30 menit lebih disukai pada suhu 4
°C untuk mencegah aktivitas neuraminidase. Jika sel darah merah ayam yang
digunakan, piring dapat dibaca dengan memiringkan ke 70° sehingga 'aliran' sel
non-agglutinated ke dasar well. sel hamster non-agglutinated muncul sebagai
tombol di bagian bawah well dan bisa lebih lama untuk menyelesaikan. Jika tidak
ada aktivitas HA, satu aliquot dari setiap panen dikumpulkan dan dipasase ke
telur selanjutnya. Semua sampel HA positif dibagi menjadi aliquot dan disimpan
pada suhu -70 ° C; satu aliquot dititrasi untuk HA cepat. Titer HA adalah
kebalikan dari pengenceran terbesar untuk menunjukkan aglutinasi. Jika titer HA
adalah 1/16 atau lebih, isolat ditandai segera. Jika titer rendah, sampel
positif harus dipasase. Perawatan harus diambil untuk menghindari partikel
mengganggu rusak oleh prapengenceran inokulum 1/10, 1/100, 1/1.000. sampel
positif yang timbul dari pengenceran tertinggi harus dipilih sebagai stok untuk
penyimpanan. Mungkin perlu untuk melakukan sebanyak lima pasase untuk
mengisolasi virus, terutama dari kuda yang divaksinasi. Jika virus belum
ditemukan oleh bagian kelima, pasase selanjutnya tidak seperti menjadi sukses.
1.2.
Isolasi virus dalam kultur sel
Kultur
sel MOCK (MOCK, ATCC CCL34) dapat digunakan untuk mengisolasi virus influenza
kuda. Sel-sel yang tumbuh ke pertemuan di tabung dan kemudian terinfeksi dalam
rangkap tiga dengan 0,25-0,5 ml setiap sampel, diproses seperti dijelaskan di
atas. Sebelum inokulasi, monolayer sel dicuci setidaknya sekali dengan media
kultur jaringan yang mengandung tripsin (2 mg/ml) tanpa serum. Kultur yang
terpelihara dengan media bebas serum yang mengandung 0,5-2 mg / ml tripsin
(diobati dengan TPCK [L-1-tosylamine-2-phenylethyl klorometil keton] untuk
menghapus chymotrypsin, tersedia pra-perawatan, misalnya dari Sigma), dan
diperiksa setiap hari untuk membuktikan efek sitopatik (CPE). Jika positif,
atau setelah 7 hari dalam banyak kasus, cairan supernatan diuji untuk HA. Cairan
dengan titer dari 1/16 ditandai segera. cairan negatif dan mereka dengan titer
<1/16 direpassase hingga lima pasase.
Atau,
sel-sel disaring untuk bukti haemadsorpsi (HAO). Prosedur ini mendeteksi
ekspresi antigen virus pada permukaan sel. Media dimusnahkan dari kultur dan
tabung dicuci dengan PBS. Satu atau dua tetes suspensi 50% dari sel darah merah
ayam atau hamster ditambahkan, tabung diputar dengan hati-hati, dan disimpan
pada suhu kamar (23 °C ± 2 °C) selama 30 menit. Sel darah merah takterikat
dicuci dengan PBS, dan budaya diperiksa secara mikroskopis untuk bukti HAO.
1.3.
Penentuan subtipe Haemagglutinin
Subtipe
HA dari isolat virus baru influenza kuda dapat ditentukan dengan
haemagglutination inhibition (HI; Bagian B.2.1) menggunakan antisera H7N7- dan
H3N8-spesifik. Isolat mungkin pertama diberi perlakuan dengan Tween 80/eter,
yang menghancurkan infektivitas virus dan mengurangi risiko kontaminasi silang.
Dalam kasus virus H3N8 khususnya, perlakuan ini meningkatkan aktivitas HA (John
& Fulginiti, 1966). Namun, perlakuan dengan Tween 80/eter juga menurunkan
spesifisitas dan dapat meningkatkan variabilitas hasil yang diperoleh. Antigen
standar harus dititrasi secara paralel dengan tes untuk mengidentifikasi virus
dan harus mencakup strain H7N7 (misalnya A/eq/Praha/56, A/eq/Newmarket/77) dan
strain H3N8 (misalnya A/eq/Newmarket/2/93, dan A/eq/Afrika Selatan/4/03 dan
A/eq/Richmond/1/07). strain virus dapat diperoleh dari Labotatorium Referensi
OIE (lihat Tabel diberikan dalam Bagian 4 Manual Terrestrial ini). Selain itu,
isolat terbaru dari wilayah geografis yang sama harus dimasukkan jika tersedia.
Antigen standar harus ditangani dengan Tween 80/ether untuk menghindari
kontaminasi silang. Tes antigen dan antigen standar selalu kembali-dititrasi untuk
mengkonfirmasi konten antigen mereka.
Sejak
1980-an, hanya subtipe virus H3N8 telah diisolasi dari kuda. HA urutan isolat
H3 kuda dapat ditentukan dengan cepat oleh RT-PCR dan sequencing, seperti yang
dijelaskan oleh Rash et al. (2014), dan didorong untuk keperluan surveilans.
Isolat
baru dari virus influenza kuda dapat lebih lanjut ditandai dengan HI
menggunakan antisera strain-spesifik. Spesies di mana antibodi ditumbuhkan akan
mempengaruhi reaktivitas silang dari antiserum, dengan musang menyediakan
antibody strain paling spesifik (Mumford, 1992). Kekhususan dan reaktivitas
silang dari sera yang juga dipengaruhi oleh jadwal imunisasi. Sera diperoleh 3
minggu setelah aplikasi antigen tunggal dianggap paling diskriminatif.
Semua
isolat harus segera dikirim ke Laboratorium Referensi Internasional yang
ditunjuk oleh OIE atau Organisasi Kesehatan Dunia (WHO) untuk dimasukkan dalam
program surveilan strain untuk memantau antigenic drift dan munculnya virus
baru.
1.4.
Penentuan subtipe Neuraminidase
Penentuan
subtype dari neuraminidase membutuhkan antisera spesifik dan tidak ada teknik
rutin tersedia. Subtyping juga dapat dilakukan dengan menggunakan primer PCR
spesifik. Sejak 1980-an hanya subtipe virus H3N8 telah diisolasi dari kuda. NA
sequensing isolat H3 kuda dapat ditentukan dengan cepat oleh RT-PCR dan
sequencing, seperti yang dijelaskan oleh Rash et al. (2014), dan didorong untuk
keperluan surveilans.
1.5.
Polymerase chain reaction
Uji
RT-PCR baik konvensional dan real-time, semakin banyak digunakan untuk deteksi
genom equine influenza di sekret hidung karena mereka lebih sensitif
dibandingkan kultur virus pada telur atau deteksi nukleoprotein menggunakan
deteksi antigen cepat /rapid antigen detection (RAD) kit untuk deteksi
influenza manusia. Sebuah probe- berdasarkan real-time RT-PCR assay berdasarkan
gen matriks dan dikembangkan untuk mendeteksi berbagai jenis influenza strain A
termasuk burung H5N1, (Heine et al., 2007) dikombinasikan dengan sistem
ekstraksi DNA otomatis untuk menetapkan sebuah uji throughput yang tinggi yang
digunakan dalam skrining massal dari kuda selama program pemberantasan di
Australia pada tahun 2007 (Foord et al., 2009). Jenis pengujian paninfluenza
telah digunakan secara efektif untuk diagnosis dan surveilans influenza kuda
oleh laboratorium Referensi OIE (Gildea et al., 2013a). TaqMan @ real-time
RT-PCR tes khusus untuk equine-2 influenza (H3N8) dan virus equine-1 (H7N7)
juga telah dijelaskan dan kit RT-PCR komersial untuk mendeteksi influenza kuda
telah tersedia (Lu et al ., 2009). Tidak ada uji RT-PCR belum divalidasi sesuai
dengan Templet Validasi OIE namun ada juga yang terakreditasi untuk ISO17025.
Meskipun
urutan genetik isolat juga bisa berasal dari tes PCR tetap penting untuk
mengisolasi virus menular dalam rangka untuk menguji sifat antigenik dari
isolat baru dan mengevaluasi antigenic drift di lapangan.
2.
Uji Serologi
Infeksi
influenza dapat dideteksi dengan melakukan tes serologi pada sera berpasangan
untuk menunjukkan kenaikan antibodi spesifik. Tes ini harus dilakukan apakah
isolasi virus telah dicoba atau tidak. Mereka kuat dan dapat membuktikan
positif dengan tidak adanya isolasi virus. Dua metode sederhana ada, HI dan
single radial haemolysis (SRH), masing-masing sama-sama efisien dan banyak
digunakan. ELISA untuk antibodi terhadap nukleoprotein influenza tersedia
tetapi kurang umum digunakan (Galvin et al., 2013). Fiksasi komplemen
/complement fixation (CF) tes juga dapat diterapkan, tetapi tidak digunakan
secara umum. sampel serum berpasangan, yaitu sampel akut dan sembuh, harus
diuji bersama-sama untuk meminimalkan dampak variabilitas inter-assay. Antigen
standar yang dijelaskan di atas (Bagian B.1.3). Jika tersedia, isolat dari
kasus baru-baru ini harus termasuk. Anti sera kuda beku-kering pasca-infeksi
untuk A/eq/Newmarket/77 (H7N7), A/eq/Newmarket/1/93 (Amerika keturunan H3N8),
A/eq/Newmarket/2/93 (Eropa keturunan H3N8), A/eq/Afrika Selatan/03/04 (Florida
Clade 1, keturunan Amerika) dan serum kuda influenza-negatif, tersedia dari
Oirectorate Eropa untuk Kualitas Obat (EOQM)2. sera ini telah ditetapkan nilai
SRHnya melalui studi kolaboratif internasional dan dapat digunakan sebagai
serum acuan utama untuk pengujian tersebut (Oaly et al, 2007;. Mumford, 2000).
2.1.
Uji Haemagglutinasi inhibisi
Antigen
yang pertama diberi perlakuan dengan Tween 80/eter dalam rangka meningkatkan
sensitivitas uji, terutama untuk virus H3N8. Uji HI juga dapat dilakukan tanpa
perlakuan eter meskipun mengurangi sensitivitas. Uji ini paling baik dilakukan
dalam plate microtitre menggunakan peralatan pengenceran yang sesuai. Sebuah
macrotest dapat digunakan, untuk antigen yang diencerkan ke titer akhir HA dari 1/8 per well dan volume untuk PBS,
sera dan antigen adalah 0,5 ml. Sera yang sebelum perlakuan untuk menghilangkan
haemagglutinins spesifik, kemudian di inaktifasi pada 56 °C selama 30 menit.
Pretretmen termasuk penggunaan salah satu dari berikut: (a) kaolin dan absorbs
RBCs, tidak dianjurkan untuk H7N7 HI, (b) kalium periodat, atau (c) Vibrio
cholerae receptor-destroying enzyme. Kalium periodat atau V. cholerae
receptor-destroying enzyme adalah pengobatan pilihan. sera diperlakukan
diencerkan dalam PBS, dosis standar antigen ditambahkan (HA titer 1/4 per well
untuk pengujian mikrotitrasi), dan ini disimpan pada suhu kamar (23 °C ± 2 °C)
selama 30 menit. Setelah tercampur baik, sel darah merah (RBCs ditambahkan dan uji dibaca 30 menit kemudian.
Titer HI dibaca sebagai pengenceran tertinggi dari serum yang memberikan
penghambatan dari aglutinasi lengkap. Antara sel darah merah ayam (1% [v/v]
paket sel) di plate microtitre V-rangkap atau sel darah merah hamster (0,5%
[v/v] paket sel) di dasar plate V atau U yang dapat digunakan. Jika sel darah
merah ayam yang digunakan, piring dapat membaca dengan memiringkan ke 70°
sehingga sel-sel non-agglutinated 'aliran' ke dasar well. sel non-agglutinasi
hamster muncul sebagai 'tombol' di dasar well dan bisa lebih lama untuk
mengendap. Titer HI adalah kebalikan dari pengenceran terbesar menunjukkan
penghambatan lengkap dari aglutinasi. Saat ini, titik cut-off untuk sampel
positif belum ditentukan untuk tes HI dan dengan demikian, titer rendah harus
dicari lebih lanjut. Titer meningkat empat kali lipat atau lebih antara sera
berasangan menunjukkan infeksi baru.
2.1.1.
Tretmen Tween 80/ether dari virus
i)
Untuk 39,5 ml cairan allantoic infektif, tambahkan 0,5 ml dari suspensi 10%
(v/v) dari Tween 80 di PBS untuk memberikan 0,125% (v/v) konsentrasi Tween 80.
ii)
Setelah pencampuran yang lembut pada suhu kamar selama 5 menit, tambahkan 20 ml
dietil eter untuk memberikan konsentrasi akhir 33,3% volume, dan campur
suspensi dengan baik pada suhu 4 °C selama 15 menit.
iii)
Setelah memungkinkan lapisan untuk memisahkan dengan tetap, menghilangkan
lapisan air yang mengandung partikel virus dipisahkan ke botol kaca dengan
tutup longgar dan memungkinkan kelebihan eter menguap dari semalaman (John
& Fulginiti, 1966). Tindakan pengamanan sambil menangani eter harus
benar-benar diamati dan kerja harus terbatas pada lemari asam.
iv)
Simpan diperlakukan virus di aliquots pada -70 °C.
2.1.2.
Titrasi dari haemagglutinasi
i)
Tambahkan 25 ml PBS untuk semua well di deretan plate mikrotiter.
ii)
Tambahkan 25 ml virus untuk well pertama kemudian menghasilkan serangkaian
pengenceran ganda di plate tinggalkan well terakhir sebagai kontrol negatif.
iii)
Tambahkan tambahan 25 ml PBS untuk semua sumur.
iv)
Tambahkan 50 ml sel darah merah untuk semua sumur. Tinggalkan pada suhu kamar
atau pada suhu 4 °C (terutama jika suhu lingkungan yang tinggi), selama 30
menit. Titer HA diambil sebagai virus pengenceran terakhir memberikan HA
parsial.
________________
2
Markas: EOQM - Dewan Eropa / Council of Europe, 7 allee Kastner, CS 30026,
F-67081 Strasbourg, Prancis.
2.1.3.
Kalium periodat sera pretreatment
i)
Campur satu volume (150 ml) serum dengan dua volume (300 ml) yang baru
disiapkan 0,016 M kalium periodat (0,38 g dalam 100 ml PBS), dan tinggalkan
pada 22 ° C (± 2 ° C) selama 15 menit.
ii)
Tambahkan satu volume lebih lanjut dari 3% gliserol di PBS untuk menetralisir
larutan ekses periodat, campur dan tinggalkan pada suhu kamar (23 ° C ± 2 ° C)
selama 15 menit.
iii)
Inactivasi pada suhu a 56°C di water bath selama 30 menit.
2.1.4.
Prosedur pengujian
i)
Mengeluarkan 25 ml PBS untuk semua well dari plate microtiter.
ii)
Tambahkan serum (25 ml) untuk well pertama dari deretan 12, kemudian
menghasilkan pengenceran serial ganda (1/8 setidaknya 1/512, memungkinkan untuk
pengenceran 1/4 dari pengobatan serum), tinggalkan yang terakhir sebagai
kontrol.
iii)
Oilute antigen untuk memberikan dosis dari 4 unit HA (dosis agglutinasi 4 x
minimum, yaitu titer /4).
iv)
Tambahkan 25 ml untuk masing-masing dengan baik, dan inkubasi pada suhu kamar
(22 °C ± 2 °C) selama 30 menit.
v)
Tambahkan 50 ml sel darah merah untuk masing-masing well. Tinggalkan pada suhu
kamar atau pada suhu 4 °C (terutama jika suhu lingkungan yang tinggi), selama
30 menit.
vi)
Pelat dapat dibaca dengan memiringkan ke 70 ° sehingga sel-sel non-agglutinasi
'mengalir' ke dasar well. Tidak ada aglutinasi yang dicatat sebagai hasil yang
positif.
2.2
Hemolisis radial Tunggal
Dalam
tes ini, antigen virus yang digabungkan untuk sel darah merah tetap yang
tersuspensi dalam agarose yang mengandung komplemen hamster (C'). Well ditekan
dalam agarose dan diisi dengan sera uji. antibodi influenza dan C 'melisiskan
sel darah merah antigen berlapis, sehingga jelas, zona hemolitik sekitar well;
ukuran zona ini berbanding lurus dengan tingkat antibodi strain-spesifik dalam
sampel serum (Morley et al., 1995).
Plate
immunodiffusion khusus (MP Biomedis) dapat digunakan untuk pengujian, tetapi
piring Petri sederhana juga cocok. Sel darah merah domba dikumpulkan ke dalam
larutan Alsever ini dicuci tiga kali. C' dapat diperoleh secara komersial, atau
serum normal hamster dapat digunakan. Antigen virus adalah stock telur tumbuh
atau preparasi pemurnian; strain yang digunakan adalah sama seperti untuk tes
HI. Virus yang digabungkan ke sel darah merah oleh kalium periodat atau kromat
klorida. Antigen berpasangan /preparasi sel darah merah dicampur dengan C',
bersama-sama dengan larutan 1% dari agarose (low melting grade) dalam PBS.
Perawatan harus dilakuan untuk memastikan bahwa suhu tidak diperbolehkan untuk
naik di atas 42 °C setiap saat. Campuran dituangkan ke plate dan tinggalkan
untuk setingan. Wells dari 3 mm dan 12 mm terpisah yang menekan di agarose
padat, setidaknya 6 mm dari tepi plate. plate tersebut dapat disimpan pada suhu
4 °C selama 12 minggu. Pelat disusun untuk setiap antigen.
Sera
tidak aktif pada 56 °C selama 30 menit, tapi tidak ada perawatan lebih lanjut
yang diperlukan. Sera berpasangan harus diuji di plate yang sama. Minimal,
antiserum subtipe khusus harus dimasukkan sebagai serum kontrol dalam satu well
pada setiap plate. Semua sera diuji di plate kontrol berisi semua komponen
kecuali virus untuk memeriksa lisis nonspesifik. Atau, virus yang tidak
terkait, seperti A/PR/8/34 (H1N1), dapat digunakan dalam piring kontrol. Sera
yang menunjukkan aktivitas hemolitik untuk sel darah merah domba harus
pre-absorbed dengan sel darah merah domba. Zona lisis harus jelas dan tidak
kabur atau tembus. Semua zona yang jelas harus diukur dan daerah hemolisis
dihitung.
2.2.1.
Persiapan reagen
i)
Saline /HEPES: 0.85% NaCl (4,25 g/500 ml); 0,05 M HEPES
(N-2-hydroxyethylpiperazine, N-2-ethanesulphonic asam; 5,95 g/500 ml); dan
0,02% natrium azida. Buat menjadi pH 6,5 dengan Na0H.
ii)
Saline /HEPES /BSA: sebagai garam /HEPES dengan 0,2% (w/v) bovine serum albumin
(BSA).
iii)
Larutan stok CrCl3 (2,25 M) 6 g/10 ml: Buat segar 1/400 pengenceran di 0,85 %
NaCl untuk setiap uji.
iv)
PBS (London) /PBS 'A': NaCl (10.00 g); KCl (0,25 g); Na2P04 (1,45 g); KH2P04
(0,25 g); dan Na azida (0,20 g). Buat hingga 1 liter dengan air suling.
v)
Agarose di PBS: Tempat labu mengandung PBS 'A' pada pengaduk. Perlahan-lahan
tambahkan 10 g agarosa pada pengadukan cairan. Cairkan dalam pressure cooker.
suspensi ke dalam botol kaca untuk penyimpanan pada 22 °C (± 2 °C).
vi)
Antigen virus: cairan allantoic mengandung virus menular dipanen dan disimpan
pada -70 °C. Kurva titrasi singkat menentukan rasio optimum dari antigen virus untuk sel darah merah yang akan
digunakan saat mempersiapkan sel darah merah domba yang peka. Strain influenza
H7N7 selalu menghasilkan zona yang jelas; strain H3N8 kadang-kadang
menghasilkan zona kabur, dalam hal ini perlu untuk mengkonsentrasikan virus
dengan sentrifugasi.
vii)
Darah domba: Kumpulkan darah ke volume yang sama dari larutan Alsever dan
simpan pada 4 °C. Mungkin perlu untuk menguji darah beberapa domba,
karakteristik sel darah merah dari domba individu bervariasi. Menjaga darah
selama 2 hari sebelum digunakan, mungkin kemudian dapat digunakan sampai 3
minggu, persediaan yang sterilitas dipertahankan.
viii)
Komplemen: Gunakan komplemen hamster yang tersedia secara komersial atau
mengumpulkan serum dari hamster muda dari berat badan 300-350 g dan simpan
dalam volume kecil pada suhu -70 °C. Untuk penggunaan, tawing dalam air dingin
dan tahan pada suhu 4 °C sebelum pencampuran.
ix)
Perlakuan pada sera: Gunakan sera yang dicairkan panas melemahkan pada 56 °C
selama 30 menit. Hindari pengulangan siklus beku-tawing.
2.2.2.
Prosedur Uji
i)
Cuci sel darah merah domba setidaknya tiga kali dalam saline /HEPES.
ii)
Siapkan volume yang sesuai dari 8% sel darah merah (v/v paket sel) dalam saline
/HEPES, setelah pertama kali dihitung jumlah plate yang diperlukan dan
memungkinkan 1 ml per cm 6 x 11 immunoplate
dan 1-2 ml ekstra.
iii)
Tambahkan antigen virus volume3 telah ditetapkan ke larutan sel darah merah 8%.
Jaga campuran pada suhu 4 °C selama 10 menit. Haemagglutination dapat diamati.
iv)
Perlahan tambahkan CrCl3 (1/400 di 0,85% NaCl) pada setengah total volume virus
/larutan sel darah merah. Jaga pada suhu 22 °C (± 2 ° C) selama 5 menit dengan
sesekali pencampuran.
v)
sedimenkan sel darah merah peka dengan mensentrifugasi pada 1500 g selama 5
menit.
vi)
Perlahan resuspensi dalam saline /HEPES /BSA dan centrifus pada 1500 g selama 5
menit.
vii)
Resuspensi sel darah merah untuk suspensi 8% di PBS 'A'.
Peelakuan
proses sensitisasi, meleleh agarosa tersebut. Tak lama sebelum digunakan, pipet
7,8 ml volume untuk botol Universal dan pertahankan pada 42 °C. Periksa agar
menjadi dingin sampai 42 °C sebelum digunakan.
2.2.3.
Preparasi dari pelat
i)
Tambahkan 0,9 ml sel darah merah domba virus-peka 7,8 ml agarose (42 °C).
Campur dengan cepat, secara halus.
ii)
Tambahkan 0,3 ml serum hamster murni. Aduk lagi dan tuangkan ke immunoplates
atas meja leveling. Atur sedemikian rupa dan udara kering tanpa tutup selama 5
menit.
iii)
Tempat tutup di pelat dansimpan pada suhu 4 °C dalam kotak lembab sampai
digunakan.
iv)
Siapkan pelat kontrol dengan sel takdisensitisasi atau sel peka dengan virus
yang tidak terkait. Batch piring yang disiapkan dapat disimpan selama beberapa
minggu.
v)
Pukul lubang 3 mm dalam set gel untuk template siap, memungkinkan untuk 16 uji
sera dan serum kontrol positif. Di plate kontrol antigen, siapkan lima baris
delapan well.
vi)
Pipet 10 µl sera uji panas tidak aktif (56 °C selama 30 menit) dan serum
kontrol positif untuk sumur yang tepat. Inkubasikan pada 34 °C selama 20 jam
dalam kotak lembab.
vii)
Ukur Diameter zona, dan hitung daerah hemolisis setelah daerah dari well telah
dikurangi.
2.2.4.
Interpretasi hasil
Untuk
hasil yang valid, positif dan negatif serum kontrol harus memberikan hasil yang
ditetapkan melalui studi kolaboratif internasional (Caly et al, 2007;. Mumford,
2000) atau jika tidak menggunakan standar internasional, hasil yang sesuai
dengan yang diharapkan atas dasar sebelum pengalaman. Area hemolisis untuk
serum kontrol harus jelas dan variasi intra-laboratorium sebaiknya tidak lebih
dari 5% untuk serum kontrol. Hasil dapat dinyatakan sebagai mm2 atau sebagai
rasio dari nilai kontrol serum. Sera memberikan hasil positif di pelat kontrol
harus terserap dengan sel darah merah domba. Untuk tujuan diagnostik, sera akut
dan konvalesen harus diuji rangkap di pelat yang sama. Peningkatan di daerah
zona diproduksi oleh serum hewan sembuh dibandingkan dengan serum akut adalah
bukti adanya infeksi. Peningkatan luas 25 mm2 atau 50% mana yang lebih kecil,
secara rutin dianggap signifikan, namun ini tergantung pada reproduksibilitas
tes dalam laboratorium, dan harus setara dengan peningkatan dua kali lipat atau
lebih dalam konsentrasi antibodi. Daerah ini dapat dihitung dari kurva standar
yang dihasilkan dari serangkaian pengenceran dari antiserum standar.
_________________
3
Siapkan tiga pelat dengan menambahkan 0,6, 1,2 atau 1,8 ml antigen virus untuk
2 ml sel darah merah. Tambahkan 1,3, 1,6 dan 1,9 ml CrCl3 masing-masing dan
resuspend untuk 2 ml di PBS 'A'. Volume optimal antigen virus adalah yang
menghasilkan zona terbesar dan paling jelas dengan serum referensi yang sesuai.
C.
PERSYARATAN VAKSIN
1.
Latar Belakang
1.1.
Penggunaan dari produk
Equine
influenza adalah penyakit self-limiting dan signifikan secara ekonomi terutama
karena sifat menular dari virus dan terganggunya kegiatan berkuda. Diagnosis
yang cepat, pembatasan gerakan dan vaksinasi adalah kunci tindakan pengendalian
untuk equine influenza. Vaksinasi menurunkan tanda-tanda klinis dan virus
shedding. Vaksin influenza tersedia secara luas dan secara rutin digunakan pada
kompetisi berkuda di Eropa, Amerika, dan Asia. Di beberapa negara, vaksinasi
adalah wajib untuk kuda sport dan kuda pacu yang bertanding di bawah aturan
organisasi berkuda. Mengikuti tujuan utama tiga dosis pada interval sekitar 0,
1 dan 6 bulan, booster tahunan adalah persyaratan minimum yang biasa. Lebih
sering vaksinasi dianjurkan untuk kuda muda dan beberapa organisasi berkuda
menghendaki booster dua tahunan.
vaksin
virus influenza kuda biasanya terdiri dari seluruh virus yang tidak aktif atau
subunit glikoprotein mereka, dengan atau tanpa ajuvan. Virus hidup yang
dilemahkan dan vaksin vektor kenari pox telah tersedia secara komersial di
beberapa negara. Imunitas yang dihasilkan oleh vaksin dilemahkan diberikan
melalui rute intramuskular sangat bergantung pada stimulasi sirkulasi antibodi
terhadap HA, yang menetralkan virus; beberapa produk telah ditunjukkan untuk merangsang
antibodi dalam sekresi pernapasan. Secara kritis integritas dan konformasi dari
HA harus dipertahankan selama prosedur inaktivasi untuk memastikan bahwa vaksin
merangsang netralisasi antibodi yang sesuai. Hal ini dapat diuji dengan
menggunakan assay imunologis seperti SRC (single difusi radial), yang mengukur
imunologi aktif HA mampu bereaksi dengan antibodi spesifik anti-HA.
Imunogenisitas vaksin dapat dikonfirmasi dengan pengukuran antibodi HA yang
distimulasi pada model binatang kecil atau spesies sasaran. Beberapa vaksin
influenza kuda termasuk seluruh virus yang tidak aktif, subunit dan vaksin
vektor kenari-pox juga telah terbukti memilikidasar potensi imunitas seluler /cell-mediated
immunity (CMI) (Gildea et al., 2013b).
Vaksin
virus-vektor hidup yang mengandung virus influenza gen encoding HA daripada
antigen, tidak dapat potensi diuji oleh SRC. Sebaliknya, titer infeksius dari
rekombinan yang digunakan sebagai ukuran potensi in-vitro dan imunogenisitas
dinilai oleh pengukuran stimulasi antibodi pada spesies sasaran.
Antibodi
terhadap HA yang diukur dengan SRH, dirangsang dengan seluruh virus yang tidak
aktif, subunit atau vaksin vektor kenari-pox berkorelasi baik dengan
perlindungan terhadap infeksi dalam sistem model tantangan eksperimental
(Edlund Toulemonde et al, 2005;. Mumford, 1983; 1994). Sebaliknya, mutan
sensitif terhadap temperatur dingin diadaptasi digunakan sebagai vaksin hidup
yang dilemahkan bereplikasi di saluran pernapasan bagian atas dan tidak
menstimulasi tingkat tinggi pada sikulasi antibodi terhadap HA namun demikian
memberikan perlindungan terhadap infeksi tantangan. Imunitas diduga dimediasi
melalui respons mukosa atau selular dari pada sirkulasi antibodi. Seperti
vaksin vektor, dalam proses control pengujian bergantung pada pengukuran virus
titer infeksius.
Pedoman
untuk produksi vaksin hewan diberikan dalam Bab 1.1.8 Prinsip produksi vaksin
hewan. Pedoman yang diberikan di sini dan dalam pasal 1.1.8 dimaksudkan untuk
bersifat umum sebagai produsen wajib memenuhi Eropa Pharmacopeia, USCA atau
persyaratan nasional dan regional lainnya.
________________________________________________________________
Semua
vaksin equine influenza harus mengandung strain epidemiologis yang relevan
Sebuah
program surveillance global equine influenza yang resmi telah ada sejak tahun
1995. Laboratorium Referensi OIE dan laboratorium lainnya berkolaborasi
mengumpulkan data tentang wabah influenza kuda dan variasi strain yang ditinjau
setiap tahun oleh Surveillance Panel Ahli /Expert Surveillance Panel (ESP)
termasuk perwakilan dari OIE dan WHO . Panel ini membuat rekomendasi pada
kebutuhan untuk memperbarui vaksin, dan ini diterbitkan setiap tahun dalam
Bulletin OIE dan di situs OIE. Kriteria untuk memperbarui vaksin influenza kuda
adalah sama dengan yang untuk vaksin influenza manusia dan berdasarkan analisis
perubahan antigenik, perubahan genetik dan, bila mungkin, data pendukung
tantangan eksperimental.
H7N7:
Banyak vaksin masih mengandung strain H7N7. Namun, Panel Ahli Surveillance
telah merekomendasikan bahwa komponen H7N7 harus dihilangkan karena laporan
dari infeksi dengan subtipe ini belum dibuktikan selama 30 tahun terakhir.
H3NB:
varian antigenik virus H3N8 co-sirkulasi (Bryant et al, 2009) dan ini penting
untuk menyertakan strain atau strain yang secara epidemiologis relevan seperti
yang direkomendasikan oleh Panel Ahli Surveillance OIE dan diterbitkan dalam
Bulletin OIE dan pada situs web OIE. Laboratories Referensi OIE dapat
memberikan bantuan dalam memilih strain vaksin yang sesuai.
________________________________________________________________
2.
Keterangan produksi dan persyaratan minimum untuk vaksin konvensional
2.1.
Karakteristik seed
2.1.1.
karakteristik biologi
Untuk
masing-masing strain vaksin, prototipe batch harus siap untuk menetapkan
kesesuaian sebagai strain vaksin, yaitu kemurnian dan keamanan harus
dikonfirmasi dengan teknik standar. Kemampuan dari banyak sheed virus untuk
meningkatkan ke titer tinggi dan menghasilkan massa antigenik yang cukup untuk
merangsang respon antibodi yang memadai dalam spesies sasaran, harus
dikonfirmasikan. Selain itu, virus vaksin diturunkan dalam sel MCCK harus
ditandai sepenuhnya untuk memastikan bahwa varian antigenik belum muncul selama
proses kultur, sehingga virus vaksin merupakan perwakilan tidak lagi dari
isolat asli.
2.1.2.
Kriteria kualitas (sterilitas, kemurnian, terbebasnya dari agen asing)
Strain
virus dapat diperoleh dari Laboratories Referensi OIE (lihat Tabel diberikan
dalam Bagian 4 Manual Terrestrial ini). Virus terpilih sebagai strain vaksin
harus dijelaskan dalam hal asal dan sejarah pasase. Strain yang dipropagasi di
rongga allantoic telur berembryo umur 10 hari 'atau kultur sel, seperti MOCK.
Semua perlakuan harus dilakukan secara terpisah untuk masing-masing strain.
pertumbuhan virus dipantau dengan tes HA. Pasase virus diidentifikasi dengan
tes serologis, seperti HI atau SRH atau dengan PCR menggunakan primer spesifik.
Jika virus vaksin ditanam pada kultur sel, studi antigenik dengan sera musang
dan MAbs harus dilakukan untuk memastikan bahwa varian virus belum dipilih
sejak pasase untuk mempersiapkan master dan virus benih. Master dan virus benih
dibagi menjadi Aliquot dan disimpan dalam bentuk beku-kering pada suhu -20 °C atau
-70 °C berikut pengujian untuk agen asing. Rekaman kondisi penyimpanan harus
dipertahankan.
Master
inoculum kultur dari masing-masing strain vaksin yang dipilih harus diproses
pada satu waktu untuk memastikan komposisi yang seragam, diuji untuk agen asing,
dan sepenuhnya ditandai. Antisera atau MAbs yang digunakan dalam tes HI untuk
mengkarakterisasi strain vaksin dapat diperoleh dari Laboratorium Referensi OIE
dan WHO.
Banyak
benih virus berasal dari banyak inoculum kultur (working seed) dan komposisinya
harus seragam, bebas dari agen asing, dan sepenuhnya menciri. Aliquots dari
benih adalah yang digunakan untuk produksi vaksin.
Master
dan banyak inoculum kultur (working seed) harus dipreparasi pada telur khusus
bebas pahogen atau, minimal, telur berasal dari kawanan yang sehat.
Jika
sel-sel MCCK digunakan untuk mempropagasi virus vaksin, master sel sebaiknya
dibentuk dan disimpan dalam nitrogen cair, dan harus diuji apakah bebas dari
agen asing sesuai Pedoman Pemerintah Kontrol Nasional.
Pemeriksaan
virus seed untuk agen asing termasuk mycoplasmas dan virus eequine lainnya
harus dilakukan dengan teknik yang tepat, termasuk inokulasi kultur jaringan
rentan dan pemeriksaan untuk efek cytopathic atau aplikasi antibodi fluorescent
untuk deteksi antigen.
Munculnya
patogen respirasi kuda umum lainnya, misalnya equine herpesviruses 1, 2, 4,
equine picornaviruses, equine viral arteritis, dan equine adenoviruses, harus
secara khusus dikecualikan harus.
Tidak
adanya bakteri harus dikonfirmasi dengan tes sterilitas standar dan uji
toksisitas pada hewan kecil.
2.2.
Metode pembuatan
2.2.1.
Prosedur
Produksi
didasarkan pada sistem seed-lot yang telah divalidasi sehubungan dengan
karakteristik strain vaksin. Di mana telur yang digunakan, masing-masing strain
dari virus yang diinokulasi secara terpisah ke dalam rongga allantoic telur
ayam berembrio umur 9-11 hari dari kawanan sehat. Telur diinkubasi pada suhu
yang sesuai selama 2-3 hari, dan cairan allantoic dikumpulkan. Atau, setiap
strain diinokulasi secara terpisah ke dalam kultur sel MCCk. Suspensi virus
masing-masing strain dikumpulkan secara terpisah dan diinaktivasi. Jika perlu,
mereka dapat dimurnikan. bahan adjuvan yang sesuai dan pengawet antimikroba dapat
ditambahkan.
Pol
virus monovalen harus dinonaktifkan sesegera mungkin setelah preparasi mereka,
dengan metode yang disetujui oleh Otoritas Pengendalian Nasional. Jika formalin
(37% formaldehid) atau beta- propiolactone (2-oxetanone) yang digunakan, konsentrasi
volume tidak melebihi 0,2%. Idealnya, pol harus ditempatka pada suhu 4 °C dan
harus diinaktivasi dalam waktu 5 hari dari panen. Inaktivasi vaksin harus
diperlihatkan. Sebuah metode yang cocok terdiri dari inokulasi 0,2 ml pol
monovalen murni dan 1/10 dan 1/100 pengenceran dari pol monovalen ke dalam
rongga allantoic kelompok telur subur (10 telur dalam setiap kelompok), dan
inkubasi telur pada suhu 33-37 °C selama 3 hari. Setidaknya 8 dari 10 telur
harus bertahan hidup di setiap tingkat dosis. Sebuah volume 0,5 ml cairan
allantoic dipanen dari setiap telur yang masih hidup. Cairan dipanen dari
masing-masing kelompok dikumpulkan, dan 0,2 ml masing-masing dari tiga pol
diinokulasi, murni, menjadi kelompok lebih lanjut dari 10 telur yang subur. Aktifitas
hemaglutinin tidak terdeteksi di kelompok-kelompok baru dari telur. Di beberapa
negara, persyaratan bahwa 80% dari telur harus bertahan hidup selama inkubasi
mungkin mustahil untuk memenuhi, dalam hal ini Otoritas Pengendalian Nasional
kemudian harus menentukan persyaratan yang dimodifikasi untuk menjadi bagus.
Sebelum inaktivasi, sampel harus dikumpulkan untuk tes sterilitas bakteri dan
jamur.
Bahan
monovalen mungkin terkonsentrasi dan dimurnikan dengan sentrifugasi kecepatan
tinggi atau metode lain yang cocok yang disetujui oleh Otoritas Pengendalian
Nasional, baik sebelum atau setelah prosedur inaktivasi. Hal ini penting untuk
mengkonsentrasi dan memurnikan virus dalam kondisi optimal, misalnya suhu yang
melestarikan sifat antigeniknya.
Pol
virus monovalen harus ditampakkan tidak mengandung virus influenza yang layak
saat diuji dengan inokulasi telur ayam berembrio ', dengan metode yang
disetujui oleh Otoritas Pengendalian Nasional. Atau, inaktivasi yang bagus juga
bisa ditunjukkan dengan inokulasi monolayers sel MCCK.
2.2.2.
Persyaratan untuk substrat dan media
Vaksin
seharusnya diproduksi dalam telur atau dalam cell line yang memenuhi
persyaratan Otoritas Kontrol Nasional. Bila mungkin penggunaan bahan asal hewan
misalnya, serum dan tripsin harus disimpan minimum. Zat yang berasal dari hewan
yang digunakan selama produksi harus sesuai, prosedur sterilisasi atau
inaktivasi divalidasi atau diuji agar tidak adanya organisme asing.
2.2.3.
Proses kontrol
Proses
kontrol yang relevan harus diterapkan sebelum dan setelah inaktivasi dan
sebelum dan setelah konsentrasi dan pemurnian.
Proses
kontrol meliputi: (a) identitas strain virus (diuji oleh HI); (B) sterilitas;
(C) titer virus; (D) konten hemaglutinin (diuji oleh sel darah merah ayam unit
agglutinating, CCA [chick cell
agglutination]); dan (e) imunologis aktif HA (diuji oleh SRC atau metode
immunochemical yang cocok lain).
2.2.4.
uji difusi radial tunggal
SRC
adalah metode yang dapat diandalkan untuk mengukur imunologi aktif HA dalam hal
µg HA, dan digunakan secara rutin untuk pengujian potensi vaksin influenza
manusia (Wood et al., 1983b).
Potensi
vaksin influenza kuda tidak aktif tergantung pada konsentrasi hemaglutinin
imunologis aktif (Wood et al., 1983a).
Penilaian
terhadap konten antigenik dari vaksin oleh CCA saja bisa kurang tepat, karena
sensitivitas pengujian ini adalah refleksi dari kemampuan strain virus untuk
menggumpalkan sel darah merah. Cisrupsi virus dapat menyebabkan
peningkatanyang jelas pada HA yang
diukur dengan CCA. CCA assay tidak menyiapkan ukuran dari sifat antigenik HA
(HA dapat mempertahankan sifat-sifatnya mengikat sel darah merah sementara
kehilangan kemampuannya untuk merangsang antibodi).
Kebanyakan
vaksin influenza kuda mengandung lebih dari satu varian dari subtipe H3N8.
Dalam hal ini, tidak mungkin untuk menilai potensi komponen H3N8 individu dari
tes serologi yang dilakukan dari sera yang dikumpulkan dari kuda atau hewan
kecil yang divaksinasi dengan produk akhir, karena reaktivitas silang antara
dua isolat dari subtipe yang sama. Dengan demikian, adalah penting bahwa metode
yang dapat diandalkan, seperti SRC, digunakan untuk mengukur potensi komponen
individu sebelum dan sesudah inaktivasi dan sebelum pencampuran dan formulasi
dengan bahan adjuvan.
Pada
uji SRC, persiapan virus dibandingkan dengan persiapan referensi dikalibrasi
konten HA yang diketahui. Antigen diperbolehkan untuk berdifusi melalui gel
yang mengandung antiserum spesifik untuk HA tertentu. Jarak disebarkan dengan
antigen sebelum presipitasi dengan antibodi yang tergabung dalam gel secara
langsung berhubungan dengan konsentrasi hemaglutinin dalam persiapan
antigennya.
Reagen
standar untuk pengujian SRC tersedia dari Laboratorium Internasional WHO
Biologi Standards4. Reagen untuk H3N8 strain A/eq/Miami/63, A/eq/Kentucky/81,
A/eq/Newmarket/1/93 (Amerika keturunan) dan A/eq/Newmarket/2/93 (keturunan
Eropa) saat ini tersedia.
2.2.5.
Uji bath produk akhir
i)
Sterilitas dan kemurnian
Tes
bahan biologis untuk sterilitas dan ter bebas dari kontaminasi dapat ditemukan
dalam bab 1.1.9.
ii)
Keselamatan
a)
Untuk inaktifasi atau subunit vaksin tidak adanya infektivitas dari virus harus
dibuktikan oleh dua pasase dalam 10 telur ayam berembrio. Cairan allantoic
seharusnya tidak memiliki aktivitas hemaglutinasi.
b)
Menggunakan tidak kurang dari tiga kuda, masing-masing kuda diinokulasi
intramuskular (di dua lokasi yang berbeda) dengan dosis vaksin yang ditetapkan
oleh pabrikan; inokulasi ini diulang 2-4 minggu kemudian. Hewan dikandangkan di
bawah pengamatan selama 10 hari setelah set kedua suntikan. Tidak ada reaksi
lokal atau sistemik yang abnormal seharusnya terjadi.
_________________
4
Lembaga Nasional Standar Biologi dan Pengendalian, Blanche Lane, South Mimms,
Potters Bar, Hertfordshire EN6 3QG, UK.
c)
Jika vaksin akan digunakan pada kuda betina, keselamatan harus dibuktikan
dengan memberikan dua dosis vaksin untuk tidak kurang dari dua kuda hamil pada
interval yang ditentukan dalam trimester untuk vaksinasi yang dianjurkan.
Petunjuk Keselamatan telah ditunjukkan pada batch prototipe, uji keamanan di
kuda betina bunting dapat dihilangkan pada pengujian rutin batch berikutnya
dari produk akhir.
iii)
Potensi batch
Berikut
pencampuran antigen virus dan adjuvant, aliquot seharusnya potensi diuji in vivo
menggunakan kuda dan hamster atau uji immunochemical alternatif yang cocok.
Adjuvant menyebabkan gangguan pada uji in-vitro kuantitatif, seperti CCA dan
SRC, meskipun SRC dapat digunakan pada produk akhir sebagai uji kualitatif
untuk menunjukkan adanya antigen untuk masing-masing strain vaksin. Untuk tes
batch yang diulang, hanya humster atau uji immunochemical alternatif yang
sesuai digunakan, tunduk pada persetujuan dari Otoritas Pengawasan Nasional.
a)
Rrespon serologis pada kuda
Untuk
uji potensi in-vivo yang valid, kuda
seronegatif yang baik harus dipilih untuk vaksinasi. kuda muda atau kuda poni
(umur tidak kurang dari 6 bulan) harus diskrining untuk kemunculan antibodi
menggunakan H7N7 dan virus H3N8 termasuk virus baru diisolasi yang relevan dengan
daerah di mana kuda-kuda yang dipelihara. Jika tes HI digunakan untuk
screening, virus H3N8 harus diberi perlakuan dengan Tween 80 /ether untuk
memaksimalkan sensitivitas uji. Atau, SRH dapat digunakan untuk menetapkan
status seronegatif hewan.
Untuk
menguji efek vaksin pada kuda, suntikkan volume sesuai dengan satu dosis vaksin
dengan rute direkomendasikan ke masing-masing lima kuda seronegatif yang
rentan. Setelah periode yang direkomendasikan antara dosis pertama dan kedua,
sebagaimana tercantum pada label, volume vaksin sesuai dengan dosis kedua
vaksin disuntikkan ke masing-masing kuda.
Tiga
sampel darah dikumpulkan dari masing-masing hewan, pertama pada saat vaksinasi
pertama, kedua 1 minggu setelah vaksinasi pertama untuk memeriksa respon anamnestic,
dan yang ketiga 2 minggu setelah vaksinasi kedua.
Uji
serologis digunakan untuk mengukur respon antibodi terhadap virus yang
terkandung dalam vaksin harus distandarisasi untuk tes potensi valid in-vivo.
Uji SRH (lihat Bagian B.2.2) lebih disukai sebagai sera acuan standar yang
tersedia untuk tujuan kontrol kualitas dari Pharmacopoeia5 Eropa. Sera ini
harus diuji secara paralel dengan sera tes untuk memastikan bahwa tes tersebut
valid sehubungan dengan sensitivitas; nilai yang diperoleh tidak berbeda dengan
yang lebih dari 20% dari nilai-nilai SRH dalam sebuah studi kolaboratif
internasional (Caly et al, 2007;. Mumford, 2000). Untuk pengulangan yang rendah
dan reproduktifitas uji HI antara laboratorium yang berbeda, tidak ada titer HI
yang dapat ditetapkan untuk sera tersebut.
Setelah
vaksinasi nilai antibodi diukur dengan SRH seharusnya tidak boleh kurang dari
150 mm2. Ini lebih tinggi dari nilai yang dibutuhkan dalam European
Pharmacopoeia Monograph untuk vaksin influenza equine in-aktif (85 mm2) sebagai
nilai ini tidak dianggap protektif. Jika nilai ditemukan untuk setiap kuda
setelah vaksinasi pertama menunjukkan bahwa telah terjadi respon anamnestic,
hasilnya tidak diperhitungkan. Sebuah tes tambahan dilakukan, seperti
dijelaskan di atas, menggantikan kuda-kuda yang menunjukkan respon anamnestic
dengan jumlah yang sama dari hewan baru.
Jika
uji HI digunakan, titer antibodi setiap serum diambil setelah vaksinasi kedua
di setiap tes tidak boleh kurang dari 1/64 (dihitung untuk serum asli, dengan
mempertimbangkan predilution dari 1/8). Atau, tingkat antibodi dirangsang oleh
vaksin yang diuji harus terbukti setidaknya sama dengan tingkat antibodi
dirangsang oleh vaksin standar diuji secara paralel yang telah ditunjukkan
sebelumnya untuk melindungi kuda terhadap infeksi tantangan.
b)
Studi tantangan pada kuda
Studi
tantangan dapat dilakukan dengan mengekspos kuda / kuda poni divaksinasi dengan
virus influenza yang mematikan secara aerosol kurang dari 2 minggu dan
sebaiknya lebih dari 3 bulan setelah dosis kedua vaksin. Perbandingan
tanda-tanda klinis, ekskresi virus dan respon serologi oleh sekelompok hewan
kontrol yang tidak divaksinasi yang diberi tatangan pada saat yang sama. Waktu
dari prosedur tantangan akan mencerminkan klaim pada lembar data mengenai
durasi imunitas. Proteksi pada 2 minggu pasca vaksinasi ketika tingkat antibodi
pada tingkat puncak mereka tidak selalu menunjukkan durasi yang baik dari
kekebalan pada kondisi lapangan.
Jika
tes untuk potensi pada kuda telah dilakukan dengan hasil yang memuaskan pada
batch vaksin yang representatif, tes ini dapat dihilangkan sebagai kontrol
rutin pada batch lain vaksin disusun dengan menggunakan sistem seed lot yang
sama, sesuai kesepakatan dengan Otoritas Kontrol Nasional.
c)
Respon serologis pada hamster
Suntik
setiap hamster yang tidak demam yang bebas dari antibodi spesifik dengan satu
diosis vaksin. Ambil sampel arahnya setelah 21 hari dan uji serumnya dengan SRH
dari HI
(Lihat
Bagian B.2.1 dan B.2.2). Lakukan tes masing-masing serum menggunakan,
masing-masing, antigen (s) dipreper dari strain (s) digunakan dalam produksi
vaksin. Titer antibodi setiap serum di setiap uji tidak boleh kurang dari titer
yang distimulasi oleh vaksin standar yang telah terbukti untuk menstimulasi
tingkat perlindungan dari antibodi pada kuda.
2.3.
Persyaratan untuk otorisasi vaksin
2.3.4.
Persyaratan keselamatan
Persyaratan
keselamatan mungkin berbeda dengan Otoritas Nasional tetapi biasanya meliputi
penilaian administrasi overdosis dan pemberian berulang satu dosis untuk kuda
muda dan kuda hamil, jika vaksin ini dimaksudkan untuk digunakan pada kuda
hamil. Untuk vaksin hidup desiminasi pada kuda yang divaksinasi dan penyebaran
strain vaksin dari kuda divaksinasi dengan tidak divaksinasi bersama dengan
konsekuensi yang mungkin harus diselidiki. Pengembalian studi virulensi harus
dilakukan oleh pasase serial vaksin hidup.
_________________
5:
Serum ke A/eq/Newmarket/1/77 (nomor katalog E0850010), A/eq/Newmarket/1/93
(E0850021) dan A/eq/Newmarket/2/93 (E0850022).
2.3.2.
Persyaratan efikasi
Persyaratan
efikasi mungkin berbeda dengan Otoritas Nasional tetapi biasanya meliputi
penilaian respon serologis pada kuda dan studi virus tantangan pada kuda yang
rentan (lihat Bagian C.2.2.5.iii.b).
Ketika
tuntutan untuk durasi imunitas yang dibuat pada lembar data, ini harus didukung
dengan data pada durasi tingkat proteksi dari antibodi yang dipelihara pada
kuda yang divaksinasi sesuai jadwal yang disarankan. tingkat antibodi yang
ditandai protektif harus divalidasi dalam studi tantangan atau dibandingkan dengan
laporan yang telah dipublikasikan.
2.3.3.
Stabilitas
Vaksin
harus disimpan pada suhu 5 ± 3 °C dan terlindung dari cahaya. Shelf life
ditandai pada lembar data harus dibuktikan dengan menguji potensi aliquot dari
waktu ke waktu menggunakan uji potensi hamster (lihat Bagian C.2.2.5.iii.c).
2.4.
Persyaratan untuk otorisasi update strain vaksin
Untuk
memungkinkan produsen vaksin untuk merespon dengan cepat untuk rekomendasi dari
Panel Ahli Surveillance, vaksin yang telah diperbarui sesuai dengan rekomendasi
OIE yang berwenang jika mereka memenuhi persyaratan untuk pengujian batch
produk akhir yang ada (lihat Bagian C.2.2.5).
Komite
Veteriner Produk Obat /The Committee for Veterinary Medicinal Products
(CVMP) untuk Agensi Eropa untuk Evaluasi
Produk Obat /Evaluation of Medicinal Products (EMEA) telah mengembangkan
Pedoman pemenuhan vaksin influenza kuda berwenang dengan rekomendasi OIE. Di
Amerika Serikat, perubahan strain virus dalam vaksin influenza kuda dibahas
dalam USCA /CVB /Veterinary Services Memorandum No 800,111, yang mengindahkan
rekomendasi OIE.
3.
Vaksin berdasarkan bioteknologi
3.1.
Vaksin yang tersedia dan keuntunganya
Vaksin
rekombinan cacar kenari tersedia di beberapa negara dan digunakan dalam program
pengendalian dan pemberantasan equine influenza di Australia pada tahun 2007.
Sebuah nukleoprotein ELISA digunakan untuk membedakan kuda yang divaksinasi
dengan vaksin rekombinan dari kuda yang telah terkena virus dengan infeksi
alami (CIVA) CIVA ini dimungkinkan karena rekombinan cacar kenari hanya
mengungkapkan gen hemaglutinin influenza kuda. Ada beberapa bukti bahwa vaksin
ini dapat digunakan untuk prime sistem kekebalan tubuh dalam menghadapi
maternal antibody (Minke et al., 2008).
3.2.
Persyaratan khusus
Pihak
nasional berwenang sering memerlukan penilaian risiko lingkungan. Ini mungkin
termasuk penilaian terhadap efek samping potensial langsung dan tidak langsung,
langsung atau tertunda dari vaksin rekayasa genetika terhadap kesehatan manusia
dan hewan dan lingkungan. Fenotip dan stabilitas genetik vaksin dan potensi
interaksi dengan organisme lain mungkin perlu dievaluasi.
Oleh
drh Giyono Trisnadi,
Disadur /diterjemahkan dari Naskah Asli: EQUINE INFLUENZA (INFECTION WITH EQUINE INFLUENZA
VIRUS) by OIE, CHAPTER 2.5.7 OIE Terrestrial Manual 2017. NB: Version adopted
by the Assembly of Delegates of The OIE in May 2016.
******