PENYAKIT EQUINE PIROPLASMOSIS PADA KUDA, TEKNIK PENERIKSAAN LAB DAN KETENTUAN VAKSINASINYA

Equine Piroplasmosis adalah penyakit protozoa bersifat tick-borne pada kuda, bagal, keledai dan zebra. Etiologi  agen penyakit adalah parasit darah Theileria equi dan Babesia caballi. Thelieria equi sebelumnya termasuk atau digolongkan sebagai Babesia equi. Hewan yang terinfeksi mungkin tetap sebagai pembawa parasit (karier) ini untuk waktu yang lama dan bertindak sebagai sumber infeksi.


******

EQUINE PIROPLASMOSIS
(Saduran)


IKHTISAR

Equine Piroplasmosis adalah penyakit protozoa bersifat tick-borne pada kuda, bagal, keledai dan zebra. Etiologi  agen penyakit adalah parasit darah bernama Theileria equi dan Babesia caballi. Theileria equi sebelumnya termasuk sebagai Babesia equi. Hewan yang terinfeksi mungkin tetap sebagai pembawa parasit (karier) ini untuk waktu yang lama dan bertindak sebagai sumber infeksi untuk kutu, yang bertindak sebagai vektor.

Pemasukan hewan karier ke daerah-daerah di mana terdapat vektor kutu lazim dapat menyebabkan penyebaran epidemi penyakit.

ldentifikasi dari agen penyakit: Kuda yang terinfeksi dapat diidentifikasi dengan ditemukannya parasit dalam pewarnaan (pengecatan) darah atau smear organ selama fase akut dari penyakit. metode pewarnaan tipe Romanovsky, seperti Giemsa, memberikan hasil terbaik. Pada hewan pembawa, parasitaemia rendah sangat sulit untuk mendeteksi parasit, terutama dalam kasus infeksi B. caballi, meskipun mereka kadang-kadang dapat ditemukan dengan menggunakan teknik apusan darah tebal.

Pasangan merozoit bergabung di ujung posterior mereka adalah fitur diagnostik infeksi B. caballi. Parasit dalam eritrosit berukuran 2 x 5 µm. Merozoit dari T. equi panjangnya kurang dari 2-3 µm, dan pyriform, bulat atau bulat telur. Karakteristik dari T. equi adalah susunan empat merozoit berbentuk buah pir membentuk tetra dikenal sebagai 'salib Maltese'.

Teknik molekuler untuk mendeteksi T. equi dan B. caballi berdasarkan uji species-specific polymerase chain reaction (PCR), menargetkan gen 1BS rRNA serta gen BC48 (B. caballi) dan EMA-1 (T. equi), telah dikembangkan dan terus berkembang. Uji ini telah terbukti sangat spesifik dan sensitif dan sangat menjanjikan untuk meningkatkan perannya dalam diagnosa infeksi. Yang penting, kekhususan PCR dapat didefinisikan melampaui evaluasi massa molekul dari amplikon. Hibridisasi dengan probe spesifik, analisis restriksi endonuklease dan sequencing dari amplikon juga tersedia.

Tes serologis: Infeksi pada hewan karier terbaik ditunjukkan dengan pengujian sera mereka dengan adanya antibodi spesifik.

Saat ini, uji indirect fluorescent antibody test (IFAT) dan kompetitif enzim-linked immunosorbent assay (C-ELISA) adalah uji utama yang digunakan untuk kualifikasi importasi kuda. Uji complement fixation test (CFT), selama bertahun-tahun sebagai tes primer, telah digantikan oleh IFA dan C-ELISA. Uji ini telah terbukti lebih efektif dalam mendeteksi hewan dan hewan yang diobati dengan obat antiparasit jangka panjang yang terinfeksi; hewan-hewan ini mungkin CF negatif tetapi masih dapat terinfeksi.

IFAT dan C-ELISA telah terbukti sangat spesifik untuk masing-masing dua spesies agen Piroplasmosis. Salah satu tantangan dengan IFAT adalah kebutuhan untuk larutan sera untuk mengurangi ikatan nonspesifik dan latar belakang lainnya, yang dapat menghalangi identifikasi parasit intra erytrhocyt. Larutan Sera untuk meningkatkan spesifisitas yang menyebabkan penurunan sensitivitas IFAT. Indirek ELISA menggunakan rekombinan T. equi dan B. caballi merozoit protein dalam uji diagnostik tampak sangat menjanjikan dalam penentuan infeksi equine Piroplasmosis yang akurat.

Persyaratan untuk vaksin: Tidak ada vaksin yang tersedia.

A. PENDAHULUAN

Equine Piroplasmosis adalah penyakit protozoa yang bersifat tick-borne pada kuda, bagal, keledai dan zebra. Baru-baru ini, infeksi dilaporkan terjadi pada unta (Sloboda et al., 2011). Agen agen etiologi dari equine piroplasmosis adalah Theileria equi dan Babesia caballi. Sekitar empat belas spesies kutu dalam genus Dermacentor, Rhipicephalus dan Hyalomma telah diidentifikasi sebagai vektor transstadial B. caballi dan T. equi, sementara delapan spesies ini juga mampu menularkan infeksi B. caballi transovarial (De Waal, 1992). Hewan yang terinfeksi mungkin tetap sebagai pembawa parasit darah (karier) ini untuk waktu yang lama dan bertindak sebagai sumber infeksi untuk vektor kutu.

Parasit terjadi di Eropa selatan, Asia, negara-negara Commonwealth, Afrika, Kuba, Amerika Selatan dan Tengah, dan bagian-bagian tertentu dari bagian selatan Amerika Serikat. Theileria equi juga telah dilaporkan dari Australia (tapi, ternyata tidak pernah ditemukan di wilayah ini), dan sekarang diyakini telah tersebar luas yang lebih luas daripada B. caballi.

Selama siklus hidup Babesia, sporozoit awalnya menyerang sel-sel darah merah (sel darah merah) di mana mereka berubah menjadi trofozoit. Dalam situasi ini trofozoit tumbuh dan membelah menjadi dua putaran, merozoit oval atau berbentuk buah pir. Merozoit dewasa sekarang mampu menginfeksi sel darah merah baru dan proses pembelahan kemudian diulang.

Untuk Babesia caballi, merozoit dalam sel darah merah yang berbentuk buah pir, 2-5 µm panjang dan dengan diameter 1,3-3,0 µm (Levine, 1985). Merozoit berpasangan yang bergabung di ujung posterior mereka dianggap menjadi fitur diagnostik infeksi caballi B..

Untuk Theileria equi, merozoit dari organisme ini relatif kecil, panjangnya kurang dari 2-3 µm (Levine, 1985), dan pyriform, bulat atau bulat telur. Karakteristik dari T. equi adalah susunan empat merozoit berbentuk buah pir, berukuran panjangnya sekitar 2 µm, membentuk tetrad dikenal sebagai susunan 'Salib Maltese' (Holbrook et al., 1968).

Pada infeksi T. equi telah ditunjukkan bahwa sporozoit terinokulasi ke kuda melalui gigitan kutu menyerang limfosit (Schein et al., 1981). Sporozoit mengalami perkembangan dalam sitoplasma limfosit ini dan akhirnya membentuk skizon seperti Theileria. Merozoit dibebaskan dari skizon ini masuk sel darah merah. penularan vertikal dari T. equi dari kuda betina ke anak kuda juga telah dilaporkan (Allsopp et al., 2007). Pada infeksi eksperimental, T. equi terdeteksi tidak hanya di dalam darah tetapi juga di jaringan lain seperti hati, limpa, paru-paru, dan sumsum tulang (Alhassan et al., 2007).

Posisi taksonomi T. equi telah menjadi kontroversi akhir akhir ini telah diterangkan ulang sebagai Theileria (Mehlhorn & Schein, 1998). Dukungan lebih lanjut sebagai hubungan erat dengan Theileria spp. juga berasal dari homologi ditemukan antara 30 dan 34 kDa protein permukaan T. equi dan protein berukuran serupa berbagai Theileria spp. (Knowles et al., 1997).

Namun demikian, posisi T. equi pada pohon filogenetik berdasarkan pada subunit kecil gen RNA ribosom adalah variabel dan sebagian besar muncul sebagai keluarga clade dari Theileria (Criado-Fornelio et al., 2003) sehingga menunjukkan bahwa T. equi adalah leluhur ke Theilerids (Criado-Fornelio et al., 2003) atau kelompok yang berbeda sama sekali (Allsopp et al., 1994). Penyelesaian T. equi genom mendukung posisi filogenetik sebagai saudara takson untuk Theileria spp. (Kappmeyer et al., 2012). Urut heterogenitas ada dalam kedua B. caballi dan T. equi yang berpotensi berdampak pada interpretasi tes diagnostik molekuler.

Tanda-tanda klinis equine piroplasmosis sering tidak spesifik, dan penyakit yang dapat dengan mudah dibingungkan dengan kondisi lain. Piroplasmosis dapat terjadi sebagai peracute, akut dan bentuk kronis. Kasus-kasus akut lebih umum, dan ditandai dengan demam yang biasanya melebihi 40 °C, nafsu makan berkurang dan malas, peningkatan pernapasan dan denyut nadi, kongesti membran mukosa, dan bulatan feses yang lebih kecil dan lebih kering dari biasanya.

Tanda-tanda klinis pada kasus subakut serupa. Selain itu, hewan yang terkena menunjukkan hilangnya berat badan, dan demam kadang-kadang intermiten. Selaput lendir bervariasi dari merah muda pucat hingga merah muda, atau kuning pucat hingga kuning cerah. Petechiae dan / atau ekimosis juga dapat terlihat pada selaput lendir. buang air besar yang normal mungkin sedikit tertekan dan hewan dapat menunjukkan tanda-tanda kolik ringan. pembengkakan edema ringan bagian distal dari tungkai kadang-kadang terjadi.

kasus-kasus kronis biasanya menyajikan tanda-tanda klinis spesifik seperti inappetence ringan, kinerja yang buruk dan penurunan massa tubuh. limpa biasanya ditemukan membesar pada pemeriksaan rektal.

Bentuk peracute langka di mana kuda ditemukan mati atau sekarat telah dilaporkan.
B. TEKNIK DIAGNOSA

Table 1. Metode pengujian yang tersedia untuk diagnosta equine piroplasmosis dan tujuanya




Metoda

Tujuan

Population bebas dari infeksi

Individu bebas dari infeksi

Contribusi pada kebijakan eradicasi

Konfirmasi dari kasus klinis

Prevalensi dari infeksi - surveillance

Status Immune  pada individu hewan dari populasi post-vaccinasi


Identifikasi agen1

Pengujian
Microscopik

-

+

-

++

+

n/a

PCR

+++

+++

+++

+++

+++

n/a


Deteksi respon immune

IFAT

++

++

++

+++

++

n/a

C-ELISA

+++

+++

+++

+++

+++

n/a

CFT

+

+

+

+

+

n/a

Kunci:
+++ = metode yang direkomendasikan; ++ = Metode yang cocok; + = Dapat digunakan dalam beberapa situasi, tetapi biaya, kehandalan, atau faktor-faktor lain sangat membatasi penerapannya;
- = Tidak sesuai untuk tujuan ini; n / a = tidak berlaku.
Meskipun tidak semua uji terdaftar sebagai kategori +++ atau ++ telah menjalani validasi formal, sifat rutin mereka dan fakta bahwa mereka telah digunakan secara luas tanpa hasil yang meragukan, membuat mereka diterima.
PCR = polymerase chain reaction; IFAT = indirect fluorescent antibody test;
C-ELISA = competitive enzyme-linked immunosorbent assay; CFT = complement fixation test.

1. Identifikasi agen penyakit
Kuda yang terinfeksi dapat diidentifikasi dengan ditemukannya parasit dalam pewarnaan darah, secara optimal dikumpulkan dari kapiler kulit superfisial, atau smear organ selama fase akut penyakit. metode pewarnaan tipe Romanovsky, seperti metode Giemsa, biasanya memberikan hasil terbaik. Namun, bahkan dalam kasus-kasus klinis akut infeksi B. caballi, parasitemia yang sangat rendah dan sulit untuk dideteksi.

Pekerja berpengalaman kadang-kadang menggunakan teknik apusan darah tebal untuk mendeteksi parasitemia yang sangat rendah. Film tebal dibuat dengan menempatkan setetes kecil (sekitar 50 µl) darah pada kaca obyek yang bersih, yang kemudian dikeringkan, pada suhu pada 80 °C selama 5 menit, dan warnai dengan 5% Giemsa untuk 20- 30 menit.

Identifikasi akurat dari spesies parasit kadang-kadang diinginkan, infeksi campuran T. equi dan B. caballi mungkin sering terjadi. Identifikasi equine piroplasmosis pada hewan karier dengan pemeriksaan apus darah tidak hanya sangat sulit, tetapi juga tidak akurat dan karena itu metode serologi lebih disukai (lihat di bawah). Namun uji serologi, dapat memberikan reaksi negatif palsu atau positif palsu (Tenter & Freidhoff, 1986).

Dalam kasus tersebut, pasase dari seluruh darah ke kuda native atau makanan kutu pada hewan tersangka telah diusulkan sebagai prosedur diagnostik tambahan. Namun, teknik ini rumit, memakan waktu dan mahal. Selanjutnya dan penting, menyangkut Animal welfare harus ditimbang terhadap kebutuhan informasi diagnostik.

Sukses dalam pembentukan in-vitro kultur T. equi dan B. caballi mungkin menjadi salah satu alternatif untuk melengkapi metode yang dijelaskan di atas, dalam rangka untuk mengidentifikasi pembawa parasit. parasit Babesia caballi yang berhasil dibiakkan dari darah dua kuda yang diuji negatif dengan tes fiksasi komplemen (CF) (Holman et al., 1993). Demikian pula, T. equi bisa dibiakkan dari kuda-kuda yang tidak menunjukkan parasitemia paten pada saat inisiasi kultur (Zweygarth et al., 1997).

Teknik molekuler untuk mendeteksi T. equi dan B. caballi telah dijelaskan. Metode ini didasarkan pada reaksi berantai polimerase (polymerase chain reaction /PCR) spesifik spesies, yang terutama menargetkan gen 18S rRNA (Criado- Fornelio et al., 2003). perbaikan lebih lanjut untuk teknik termasuk nested-PCR (Rampersad et al., 2003), loop- mediated isothermal amplification (LAMP) (Alhassan et al., 2007) dengan melaporkan peningkatan sensitivitas, yang sangat sensitive Reverse Line Blot assay (RLB) dan multipleks PCR untuk deteksi simultan dan identifikasi spesies Theileria dan Babesia pada kuda (Alhassan et al., 2005). Akuisisi genom T. equi memberikan kesempatan tambahan untuk meningkatkan dan memperluas modalitas diagnostik untuk parasit ini (Kappmeyer et al., 2012).

______________
1 = Kombinasi metode identifikasi agen diterapkan pada sampel klinis yang sama adalah sangat dianjurkan.

2. uji serologis
Adalah sangat sulit untuk mendiagnosa organisme pada hewan karier dengan cara pemeriksaan mikroskopis dari ulas darah. Selain itu, tidak ada artinya untuk dilakukan dalam skala besar. Oleh karena itu pengujian serologis hewan direkomendasikan sebagai metode yang disukai dari diagnosis, terutama ketika kuda ditujukan untuk diimpor ke negara-negara di mana penyakit ini tidak terjadi, tetapi ada vektornya.

Sera harus dikumpulkan dan dikirim ke laboratorium diagnostik sesuai dengan spesifikasi dari laboratorium itu. Kuda untuk ekspor yang telah mengalami tes serologi dan terbukti bebas dari infeksi, harus bebas dari kutu untuk mencegah kejadian infeksi.

Sejumlah teknik serologi telah digunakan dalam diagnosis Piroplasmosis, seperti CFT, uji indirect fluorescent antibody test (IFAT)) dan enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Selain itu, tes immunochromatographic sederhana dan cepat untuk T. equi juga telah dijelaskan dan mungkin menjadi pengujian yang sangat berguna untuk skrining massal sampel serum (Huang et al., 2004).

2.1.  Uji Indirect fluorescent antibody
The IFAT telah berhasil diaplikasikan pada diagnosis diferensial untuk infeksi T. equi dan B. caballi. (Madden & Holbrook, 1968). Untuk mengetahui reaksi positif yang kuat relatif sederhana, tetapi setiap perbedaan antara reaksi positif dan negatif yang lemah membutuhkan pengalaman yang cukup dalam penafsiran.

Penjelasan rinci tentang protokol dari IFAT telah diberikan (Madden & Holbrook, 1968). Salah satu tantangan dengan IFAT adalah kebutuhan untuk larutan sera untuk mengurangi ikatan non spesifik dan keadaan latar belakang, yang dapat menghalangi identifikasi parasit intra-erytrhocytic. Pengenceran sera untuk meningkatkan spesifisitas menyebabkan penurunan sensitivitas IFAT. Contoh dari protokol IFA diberikan di bawah ini.

2.1.1. Produksi antigen
Darah untuk antigen diperoleh dari kuda dengan peningkatan parasitemia, idealnya 2-5%. hewan karier yang telah menghasilkan antibodi tidak cocok untuk produksi antigen. Atau, kultur parasit in vitro dapat digunakan untuk persiapan slide antigen untuk menghindari kontaminasi antibodi untuk sel darah merah yang terinfeksi dan untuk pasokan konstan sel darah merah yang terinfeksi, terutama untuk B. cabalii. Darah (sekitar 15 ml) dikumpulkan dalam 235 ml phosphate-buffered saline (PBS), pH 7,2. Sel darah merah dicuci tiga kali dalam PBS dingin (1000 g selama 10 menit pada suhu 4 °C).

Cairan supernatan dan lapisan sel kulit putih dibuang setelah setiap pencucian. Setelah pencucian terakhir, sel darah merah dikemas diencerkan dengan volume awal dengan 4% fraksi V bovine serum albumin dibuat di PBS, yaitu asli volume sel dikemas = 30% sehingga sepertiga terdiri dari sel darah merah. Jika volume RBC asli 15 ml, kemudian 5 ml sel darah merah dikemas + 10 ml 4% bovine albumin di dalam PBS antigen.

Setelah pencampuran menyeluruh, antigen ditempatkan pada well yang siap pada slide kaca menggunakan template atau jarum suntik. Atau, sel-sel dapat menyebar dengan lancar ke mikroskop slide, meliputi seluruh slide dengan bahkan, film yang cukup tebal. slide ini dibiarkan kering, dibungkus kertas lembut dan disegel dalam kantong plastik atau dibungkus dalam aluminium foil, dan disimpan pada suhu -20 °C hingga 1 tahun.

2.1.2. Prosedur pengujian
i) Setiap sampel serum diuji terhadap antigen B. caballi dan T. equi.

ii) Sebelum menggunakan, slide antigen beku dikeluarkan dari penyimpanan pada -20 °C dan diinkubasi pada 37 °C selama 10 menit.

iii) Smears antigen kemudian dikeluarkan dari penyimpanan mereka dan pastikan tetap pada aseton kering dingin (-20 °C) selama 1 menit. Slide dari produksen komersial yang tersedia adalah yang pasti.

iv) Jika Smear telah disiapkan pada seluruh permukaan slide, kotak (jumlahnya 14-21, yaitu 2-3 baris dari 7 masing-masing) terbentuk pada smear antigen dengan cat kuku atau pengeringan cepat setengah mounting (yaitu Cystoseal).

v) Uji, positif dan negatif serum kontrol yang diencerkan dari 1/80 ke 1/1280 dalam PBS. Negatif dan positif serum kontrol termasuk dalam setiap tes.

vi) Sera diterapkan (10 µl masing-masing) pada pengenceran sesuai dengan well yang berbeda atau kotak pada smear antigen, diinkubasi pada 37 °C selama 30 menit, dan dicuci beberapa kali dalam PBS dan sekali di dalam air.

vii) Immunoglobulin anti-kuda disiapkan pada kelinci dan dikonjugasi dengan fluorescein isothiocyanate (konjugasi ini tersedia secara komersial) diencerkan dalam PBS dan diaplikasikan pada smear, yang kemudian diinkubasi dan dicuci seperti sebelumnya.

viii) Setelah pencucian akhir, dua tetes larutan yang mengandung bagian yang sama dari gliserin dan PBS ditempatkan pada setiap smear dan dipasang dengan penutup-slip.

ix) Smear tersebut kemudian diperiksa di bawah mikroskop untuk parasit fluoresens. Sera diencerkan 1/80 atau lebih yang menunjukkan fluoresensi yang kuat biasanya dianggap positif, meskipun pertimbangan juga diberikan kepada pola fluoresensi dari kontrol positif dan negatif.

2.2. Competitive enzyme-linked immunosorbent assay
Sejumlah antigen rekombinan untuk digunakan dalam ELISA telah dijelaskan. Rekombinan T. equi (EMA-1; EMA-2) dan B. protein caballi (RAP-1; Bc48) telah diproduksi di Escherichia coli (Huang et al, 2003;. Kappmeyer et al, 1999;. Knowles et al., 1992) atau dalam sel serangga dengan baculovirus (Xuan et al., 2001).

Antigen rekombinan yang diproduksi di E. coli atau dengan baculovirus memiliki keuntungan jelas menghindari kebutuhan untuk menginfeksi kuda untuk produksi antigen, dan menghilangkan reaksi silang dari berpengalaman di masa lalu dengan antigen crude ELISA. Mereka juga menyediakan sumber yang konsisten dari antigen untuk distribusi internasional dan standarisasi.

Indirect ELISA menggunakan EMA-2 dan BC48 telah menunjukkan sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi dalam mendeteksi antibodi pada kuda yang terinfeksi (Huang et al, 2003;. Ikadai et al, 1999.). Hasil awal dari uji ini menjanjikan dan merupakan validasi lebih lanjut dari tes sedang berlangsung.

Inhibisi kompetitif ELISA (C-ELISA) menggunakan protein EMA-1 dan antibodi monoklonal spesifik (MAb) yang mendefinisikan epitop protein merozoit permukaan, telah digunakan dalam C-ELISA untuk T. equi (Knowles et al., 1992). Ini C-ELISA mengatasi masalah kemurnian antigen, sebagai kekhususan pengujian ini hanya bergantung pada kekhususan yang didefinisikan oleh MAb T. equi epitop. Korelasi 94% ditunjukkan antara C-ELISA dan CFT dalam mendeteksi antibodi terhadap T. equi. Sera yang memberi hasil discrepant dievaluasi karena kemampuan mereka untuk immunopresipitasi 35S-metionin-label produk in-vitro dari T. equi merozoit mRNA. Sampel yang dimana C-ELISA positif dan CFT negatif jelas diendapkan beberapa protein T. equi. Namun, immunopresipitasi hasil dengan sampel serum dimana yang C-ELISA negatif dan CFT positif tidak meyakinkan (Knowles et al., 1991).

C-ELISA ini untuk T. equi juga divalidasi di Maroko dan Israel, memberikan konkordansi dari 91% dan 95,7% dengan IFAT, masing-masing (Rhalem et al, 2001;. Shkap et al., 1998). A setara C-ELISA telah dikembangkan menggunakan rekombinan B. caballi rhoptry-terkait protein 1 (RAP-1) dan reaktif MAb dengan epitop peptida dari kDa antigen 60 B. caballi (Kappmeyer et al., 1999).

Hasil dari 302 sampel serum diuji dengan ini C-ELISA dan CFT menunjukkan 73% konkordansi. Dari 72 sampel yang dimana CFT negatif dan C-ELISA positif, 48 (67%) yang terbukti positif pada IFAT, sementara empat dari lima sampel yang diuji CFT positif dan C-ELISA negatif positif pada IFAT (Kappmeyer et al., 1999).

Sebuah uji protokol untuk Piroplasmosis kuda C-ELISA telah dijelaskan dan digunakan untuk studi validasi tambahan (Departemen Pertanian Amerika Serikat [USDA], 2005). Kekhususan jelas dari T. equi. dan B. caballi C-ELISA di antara 99,2% dan 99,5% menggunakan serum dari 1.000 kuda diduga bebas dari Piroplasmosis. Seribu kuda asing dari status infeksi tidak diketahui diuji oleh C-ELISA dan CFT dengan sensitivitas yang lebih besar dari C-ELISA. Hasilnya adalah 1,1% (T. equi) dan 1,3% (B. caballi) hewan lebih seropositif terdeteksi oleh C-ELISA dari oleh CFT; hasil positif tambahan dikonfirmasi oleh IFAT.

Sebuah studi serupa dari 645 kuda asal asing diuji untuk tujuan impor dan pra-impor menggunakan perlakuan panas sera (58 °C selama 30 menit), dan mengakibatkan 3,6% (T. equi) dan 2,1% (B. caballi) lebih hewan seropositif terdeteksi oleh C-ELISA daripada CFT tersebut. Kedua C-ELISA yang sangat direproduksi dengan well ke well, plate ke plate, dan sehari-hari, dengan variasi keseluruhan ± 1,2% dan ± 1,6% untuk masing-masing T. equi dan uji B. caballi.

Protokol C-ELISA diberikan di bawah ini.
Sebuah penjelasan rinci tentang produksi antigen dan tes protokol telah diberikan oleh National Veterinary Services Laboratories (NVSL) dari USDA (2005). Sebuah kit komersial yang sekarang tersedia yang didasarkan pada antigen yang sama dan antibodi monoklonal).

2.2.1. Larutan
i) Antigen lapisan penyangga
Siapkan volume antigen-lapisan penyangga yang diperlukan menggunakan jumlah bahan berikut per liter: 2,93 g natrium bikarbonat; 1.59 g natrium karbonat; air murni ultra cukup untuk melarutkan, dan membuat hingga 1 liter dengan air ultra-murni. Sesuaikan dengan pH 9,6.

ii) Laruran pencuci C-ELISA (pengencer garam tinggi)
Siapkan volume larutan pencuci dari C-ELISA diperlukan dengan menggunakan jumlah berikut bahan per liter: 29,5 g natrium klorida; 0,22 g monobasa natrium fosfat; 1,19 g dibasic sodium fosfat; 2,0 ml Tween 20; air ultra-murni cukup untuk melarutkan, dan membuat hingga 1 liter dengan air ultra-murni. Campur dengan baik. Menyesuaikan pH 7,4. Sterilkan dengan autoklaf pada 121 ° C.

2.2.2. Produksi antigen
Kultur  E. coli berubah beku diinokulasi pada 1/10.000 pengenceran ke dalam setiap standar non selektif kaldu pertumbuhan bakteri (misalnya Luria broth) yang mengandung menambahkan karbenisilin (100 ug/ml) dan isopropil-thiogalactoside (IPTG, 1 mM).

Kultur diinkubasi pada pengaduk orbital disetel pada 200 rpm pada suhu 37 °C semalam. Sel tumbuh semalam dipanen dengan sentrifugasi (5000 g selama 10 menit), dicuci di 50 mM Tris/HCl dan penyangga 5 m asam etilen diamin tetra-asetat (ethylene diamine tetra-acetic acid /EDTA), pH 8,0, dan dipanen lagi seperti sebelumnya. (Antigen tersedia dari NVSL, Kotak Pos 844, Ames, Iowa 50010, USA.)

Sel diresuspensi sampai 10% dari volume asli dalam penyangga  Tris/EDTA ke yang 1 mg/ml lisozim telah ditambahkan, dan diinkubasi pada es selama 20 menit. Nonidet P-40 deterjen (NP-40) kemudian ditambahkan dengan konsentrasi akhir 1% (v/v), vortex, dan campuran diinkubasi pada es selama 10 menit.

Materi yang selanjutnya disonikasi empat kali selama 30 detik setiap kali di 100 watt, di atas es, memungkinkan 2 menit antara sonikasi untuk bahan untuk tetap dingin. Sonikan tersebut disentrifugasi pada 10.000 g selama 20 menit.

Supernatan yang dihasilkan dibagikan dalam 0,5 ml aliquot dalam tabung microcentrifus dan kemudian dapat disimpan pada suhu -70 ° C selama beberapa tahun. Kehadiran hospes antigen bakteri heterolog tidak mengganggu pengikatan antibodi anti-piroplasma spesifik kuda atau pengikatan MAbs dipasangkan ke masing epitop antigen rekombinan mereka, dan dikonfirmasi oleh prosedur berikut.

Antigen yang mengandung supernatan adalah control kualitas dengan titrasi mereka dengan pasangan MAbs dan dengan mengacu monospecific antisera kuda untuk memverifikasi kedua tingkat yang memadai dari ekspresi dan spesifisitas lengkap untuk spesies homolog agen Piroplasmosis. serum yang normal (serum negatif) kontrol tidak harus mengganggu pengikatan MAbs atau sera referensi kuda positif untuk mempercepat persiapan antigen.

2.2.3. Prosedur pengujian
i) Plate mikrotitrasi disusun dengan melapisi well dengan 50  µl antigen T. equi atau antigen B. caballi dengan diencerkan dalam buffer antigen-coating. Pengenceran digunakan ditentukan dengan standar teknik titrasi serologis. Pelat tersebut disegel dengan pita penyegelan, disimpan semalam pada suhu 4 °C, dan dibekukan pada suhu -70 °C. Pelat dapat disimpan pada suhu -70 °C hingga 6 bulan.

ii) Primer anti-T. equi atau anti-B. caballi MAb dan konjugat antibodi-peroksidase sekunder diencerkan seperti yang diarahkan oleh produsen pada saat digunakan dalam C-ELISA, dengan penyangga antibodi-diluting (disertakan dengan test kit).

iii) Pelat dicairkan pada suhu kamar, larutan pelapis dialirkan, dan piring dicuci dua kali dengan C-ELISA larutan pencuci.

iv) Kontrol serum dan uji sampel serum diencerkan 1/2 dengan serum-diluting buffer sebelum 50 µl sera ditambahkan ke well. Setiap sampel serum yang tidak diketahui diuji di well tunggal atau ganda. serum kontrol positif dan blank diuji ganda sementara kontrol negatif diuji dalam tiga ganda pada bagian yang berbeda dari well.

Pelat diinkubasi tertutup, pada suhu kamar (21-25 °C) selama 30 menit di ruang lembab, dan kemudian dicuci tiga kali di pelarut pencuci C-ELISA.

v) Semua well kemudian menerima 50 µl/well dari pengenceran primer anti-T. equi atau anti-B. caballi MAb. (MAb diproduksi dalam bioreaktor kultur sel dan tersedia dari NVSL, PO Box 844, Ames, Iowa 50010, USA.) Pelat diinkubasi tertutup selama 30 menit pada suhu kamar (21-25 °C) dalam ruang lembab , dan kemudian dicuci tiga kali dalam pelarut pencuci C-ELISA.

vi) Pengenceran sekunder konjugat anti-murine peroksidase IgG (50 µl/well) ditambahkan ke masing-masing setiap well. Pelat diinkubasi tertutup selama 30 menit pada suhu kamar (21-25 °C) dalam ruang lembab, dan kemudian dicuci tiga kali dalam pelarut pencuci C-ELISA.

vii) Substrat enzim Chromogenic (50 µl/well) ditambahkan ke semua well, dan pelat diinkubasi selama 15 menit pada suhu kamar (21-25 °C) selama perkembangan warna.

viii) Perkembangan warna dihentikan dengan menambahkan 50 µl larutan stop untuk semua well dan pelat dibaca langsung pada pelat rider.

ix) Pelat dibaca pada 620, 630 atau 650 nm panjang gelombang (OD). Rata-rata OD dihitung untuk duplikat well untuk semua serum kontrol dan well kosong. Untuk uji valid, rata rata (Mean) dari kontrol negatif harus menghasilkan OD >0.300 dan <2.000. Rata rata (mean) serum kontrol positif harus menghasilkan penghambatan 40%.

x) Persentase penghambatan [% I] dihitung sebagai berikut:% I = 100 - [(sampel OD x 100) + (Mean kontrol OD negatif)].

xi) Jika sampel uji menghasilkan 40% penghambatan itu dianggap positif. Jika sampel uji menghasilkan <40% penghambatan itu dianggap negatif.

2.3. Uji Complement fixation test
CFT yang telah digunakan di masa lalu oleh beberapa negara dan masih banyak digunakan di beberapa daerah untuk memenuhi syarat importasi kuda. Sebuah penjelasan rinci tentang produksi antigen dan protocol uji telah diberikan (misalnya: USDA, 1997).

CFT adalah akurat untuk mendeteksi dini (akut) infeksi saja, dimana tujuan itu menunjukkan sensitivitas yang baik dan spesifisitas, tetapi mungkin tidak mengidentifikasi semua hewan yang terinfeksi, terutama mereka yang telah diobati atau yang menghasilkan reaksi anti-komplementer, atau karena ketidakmampuan IgG (T) (imunoglobulin isotipe utama equidae) untuk menetapkan komplemen hamster.

Antigen untuk CFT dibuat oleh infeksi eksperimental dari kuda, ini menimbulkan kekhawatiran mengenai animal welfare. Oleh karena itu, ada kemungkinan bahwa CFT akan dihentikan di masa depan; IFAT dan C-ELISA telah mengganti sebagai tes yang ditentukan untuk perdagangan internasional.

Contoh dari protokol CFT diberikan di bawah ini.

2.3.1. Larutan
i) larutan Alsever
Siapkan 1 liter larutan Alsever ini dengan melarutkan 20,5 g glukosa; 8,0 g natrium sitrat; 4,2 g natrium klorida dalam air suling yang cukup. Sesuaikan sehingga pH 6,1 menggunakan asam sitrat, dan buat volume menjadi 1 liter dengan air suling. Disterilkan dengan filtrasi.

ii) Buffer Stock veronal (5x)
Larutkan berikut dalam 1 liter air suling: 85,0 g natrium klorida; 3,75 g natrium 5,5 dietil barbiturat; 1,68 g magnesium klorida (MgCl2.6H20); 0,28 g kalsium klorida. Larutkan 5,75 g asam dietil barbiturat 5,5 di 0,5 liter air suling panas (dekat mendidih).

Dinginkan larutan asam ini dan tambah larutan garam. Buat untuk 2 liter dengan air suling dan simpan pada suhu 4 °C. Untuk mempersiapkan pengenceran bekerja, tambahkan larutan stok satu bagian ke empat bagian air suling. PH akhir harus 7,4-7,6.

2.3.2. Produksi antigen
Darah diperoleh dari kuda dengan parasitemia tinggi (mis 3-7% parasitemia untuk B. caballi dan 60-85% untuk T. equi), dan dicampur dengan volume yang sama dari larutan Alsever sebagai antikoagulan. Plasma /Alsever ini supernatan dan buffy coat dibuang ketika sel darah merah telah menetap ke bagian bawah labu. Sel darah merah dicuci beberapa kali dengan buffer Veronal dingin dan kemudian pisahkan. Antigen pulih dari lisis dengan sentrifugasi pada 30.900 g selama 30 menit.

Antigen rekoveri dicuci beberapa kali dalam penyangga Veronal dingin dengan sentrifugasi pada 20.000 g selama 15 menit. Polivinilpirolidon 40.000 (1-5% [w/v]) ditambahkan sebagai stabilisator dan persiapan dicampur pada pengaduk magnetik selama 30 menit, disaring melalui dua ketebalan kasa steril, dibagikan ke dalam volume 2 ml dan beku-kering. antigen kemudian dapat disimpan pada suhu di bawah -50 °C selama beberapa tahun.

2.3.3. Prosedur pengujian
i) Kekhasan dan potensi setiap batch antigen harus diperiksa terhadap antisera standar diketahui kekhususan dan potensinya. pengenceran antigen yang optimal juga ditentukan dalam kotak-kotak titrasi awal.

ii) Uji sera yang tidak aktif selama 30 menit pada 58 °C (sera keledai dan bagal yang tidak aktif pada suhu 62.5 ° C selama 35 menit) dan diuji di pengenceran 1/5 samapai 1/5120. Penyangga Veronal digunakan untuk semua pengenceran.

iii) Komplemen disiapkan dan dititrasi spektrofotometrinya untuk menentukan 50 % dosis hemolitik (C'H50) (Stiller et al., 1980) dan digunakan dalam tes di lima kali C'H50. Sistem hemolitik terdiri dari bagian yang sama dari suspensi 2% domba (RBC) dan penyangga Veronal dengan 5 dosis minimum hemolitik (MHDs) dari hemolisin (amboceptor) (USDA, 1997). Beberapa laboratorium menggunakan dua kali dosis hemolitik 100%, yang memberikan sensitivitas setara.

iv) Uji telah disesuaikan dengan pelat mikrotitrasi (Herr et al., 1985). Total volume dari tes ini adalah 0,125 ml, terdiri dari bagian yang sama (0,025 ml) dari antigen, pelengkap (lima kali C'H50) dan serum diencerkan. Inkubasi dilakukan selama 1 jam pada suhu 37 °C.

v) Porsi ganda (0,05 ml) dari sistem hemolitik ditambahkan dan plate diinkubasi lagi selama 45 menit pada suhu 37 ° C dengan pengocok (shaker) setelah 20 menit.

vi) Plate disentrifugasi selama 1 menit pada 200 g sebelum membacanya melalui cermin.

vii) Yang lisis 50% dicatat sebagai positif, dengan titer yang menjadi larutan serum terbesar memberikan lysis 50%. Titer 1/5 dianggap sebagai positif. Sebuah set lengkap kontrol (sera positif dan negatif) harus disertakan dalam setiap uji serta antigen kontrol dibuat dari normal (tidak terinfeksi) sel darah merah kuda.

Sampel Antikomplementer diperiksa dengan IFAT. Sera keledai sera sering kali anti-complementary.
C. PERSYARATAN VAKSIN

Tidak ada vaksin yang tersedia saat ini.

D. DAFTAR PUSTAKA
Ada pada Penyadur/Penulis

Oleh drh Giyono Trisnadi,

Diterjemahkan /Disadur dari Naskah Asli:
EQUINE PIROPLASMOSIS
by OIE, CHAPTER 2.5.8 OIE Terrestrial Manual 2016.

NB: Version Adopted by The world Assembly of Delegates of The OIE in May 2014

PENTING UNTUK PETERNAKAN: