Equine
Piroplasmosis adalah penyakit protozoa bersifat tick-borne pada kuda, bagal,
keledai dan zebra. Etiologi agen
penyakit adalah parasit darah Theileria equi dan Babesia caballi.
Thelieria equi sebelumnya termasuk atau digolongkan sebagai Babesia equi. Hewan yang terinfeksi
mungkin tetap sebagai pembawa parasit (karier) ini untuk waktu yang lama dan
bertindak sebagai sumber infeksi.
******
EQUINE
PIROPLASMOSIS
(Saduran)
IKHTISAR
Equine Piroplasmosis adalah penyakit protozoa bersifat tick-borne pada kuda, bagal, keledai dan zebra. Etiologi agen penyakit adalah parasit darah bernama Theileria equi dan Babesia caballi. Theileria equi sebelumnya termasuk sebagai Babesia equi. Hewan yang terinfeksi mungkin tetap sebagai pembawa parasit (karier) ini untuk waktu yang lama dan bertindak sebagai sumber infeksi untuk kutu, yang bertindak sebagai vektor.
Pemasukan
hewan karier ke daerah-daerah di mana terdapat vektor kutu lazim dapat
menyebabkan penyebaran epidemi penyakit.
ldentifikasi
dari agen penyakit: Kuda yang terinfeksi dapat diidentifikasi dengan
ditemukannya parasit dalam pewarnaan (pengecatan) darah atau smear organ selama
fase akut dari penyakit. metode pewarnaan tipe Romanovsky, seperti Giemsa,
memberikan hasil terbaik. Pada hewan pembawa, parasitaemia rendah sangat sulit
untuk mendeteksi parasit, terutama dalam kasus infeksi B. caballi, meskipun
mereka kadang-kadang dapat ditemukan dengan menggunakan teknik apusan darah
tebal.
Pasangan
merozoit bergabung di ujung posterior mereka adalah fitur diagnostik infeksi B.
caballi. Parasit dalam eritrosit berukuran 2 x 5 µm. Merozoit dari T. equi
panjangnya kurang dari 2-3 µm, dan pyriform, bulat atau bulat telur.
Karakteristik dari T. equi adalah susunan empat merozoit berbentuk buah pir
membentuk tetra dikenal sebagai 'salib Maltese'.
Teknik
molekuler untuk mendeteksi T. equi dan B. caballi berdasarkan uji
species-specific polymerase chain reaction (PCR), menargetkan gen 1BS rRNA
serta gen BC48 (B. caballi) dan EMA-1 (T. equi), telah dikembangkan dan terus
berkembang. Uji ini telah terbukti sangat spesifik dan sensitif dan sangat
menjanjikan untuk meningkatkan perannya dalam diagnosa infeksi. Yang penting,
kekhususan PCR dapat didefinisikan melampaui evaluasi massa molekul dari
amplikon. Hibridisasi dengan probe spesifik, analisis restriksi endonuklease
dan sequencing dari amplikon juga tersedia.
Tes
serologis: Infeksi pada hewan karier terbaik ditunjukkan dengan pengujian sera
mereka dengan adanya antibodi spesifik.
Saat
ini, uji indirect fluorescent antibody test (IFAT) dan kompetitif enzim-linked
immunosorbent assay (C-ELISA) adalah uji utama yang digunakan untuk kualifikasi
importasi kuda. Uji complement fixation test (CFT), selama bertahun-tahun
sebagai tes primer, telah digantikan oleh IFA dan C-ELISA. Uji ini telah
terbukti lebih efektif dalam mendeteksi hewan dan hewan yang diobati dengan
obat antiparasit jangka panjang yang terinfeksi; hewan-hewan ini mungkin CF
negatif tetapi masih dapat terinfeksi.
IFAT
dan C-ELISA telah terbukti sangat spesifik untuk masing-masing dua spesies agen
Piroplasmosis. Salah satu tantangan dengan IFAT adalah kebutuhan untuk larutan
sera untuk mengurangi ikatan nonspesifik dan latar belakang lainnya, yang dapat
menghalangi identifikasi parasit intra erytrhocyt. Larutan Sera untuk
meningkatkan spesifisitas yang menyebabkan penurunan sensitivitas IFAT. Indirek
ELISA menggunakan rekombinan T. equi dan B. caballi merozoit protein dalam uji
diagnostik tampak sangat menjanjikan dalam penentuan infeksi equine
Piroplasmosis yang akurat.
Persyaratan
untuk vaksin: Tidak ada vaksin yang tersedia.
A.
PENDAHULUAN
Equine
Piroplasmosis adalah penyakit protozoa yang bersifat tick-borne pada kuda,
bagal, keledai dan zebra. Baru-baru ini, infeksi dilaporkan terjadi pada unta
(Sloboda et al., 2011). Agen agen etiologi dari equine piroplasmosis adalah
Theileria equi dan Babesia caballi. Sekitar empat belas spesies kutu dalam
genus Dermacentor, Rhipicephalus dan Hyalomma telah diidentifikasi sebagai
vektor transstadial B. caballi dan T. equi, sementara delapan spesies ini juga
mampu menularkan infeksi B. caballi transovarial (De Waal, 1992). Hewan yang
terinfeksi mungkin tetap sebagai pembawa parasit darah (karier) ini untuk waktu
yang lama dan bertindak sebagai sumber infeksi untuk vektor kutu.
Parasit
terjadi di Eropa selatan, Asia, negara-negara Commonwealth, Afrika, Kuba,
Amerika Selatan dan Tengah, dan bagian-bagian tertentu dari bagian selatan
Amerika Serikat. Theileria equi juga telah dilaporkan dari Australia (tapi,
ternyata tidak pernah ditemukan di wilayah ini), dan sekarang diyakini telah
tersebar luas yang lebih luas daripada B. caballi.
Selama
siklus hidup Babesia, sporozoit awalnya menyerang sel-sel darah merah (sel
darah merah) di mana mereka berubah menjadi trofozoit. Dalam situasi ini
trofozoit tumbuh dan membelah menjadi dua putaran, merozoit oval atau berbentuk
buah pir. Merozoit dewasa sekarang mampu menginfeksi sel darah merah baru dan
proses pembelahan kemudian diulang.
Untuk
Babesia caballi, merozoit dalam sel darah merah yang berbentuk buah pir, 2-5 µm
panjang dan dengan diameter 1,3-3,0 µm (Levine, 1985). Merozoit berpasangan
yang bergabung di ujung posterior mereka dianggap menjadi fitur diagnostik
infeksi caballi B..
Untuk
Theileria equi, merozoit dari organisme ini relatif kecil, panjangnya kurang
dari 2-3 µm (Levine, 1985), dan pyriform, bulat atau bulat telur. Karakteristik
dari T. equi adalah susunan empat merozoit berbentuk buah pir, berukuran
panjangnya sekitar 2 µm, membentuk tetrad dikenal sebagai susunan 'Salib
Maltese' (Holbrook et al., 1968).
Pada
infeksi T. equi telah ditunjukkan bahwa sporozoit terinokulasi ke kuda melalui
gigitan kutu menyerang limfosit (Schein et al., 1981). Sporozoit mengalami
perkembangan dalam sitoplasma limfosit ini dan akhirnya membentuk skizon
seperti Theileria. Merozoit dibebaskan dari skizon ini masuk sel darah merah.
penularan vertikal dari T. equi dari kuda betina ke anak kuda juga telah
dilaporkan (Allsopp et al., 2007). Pada infeksi eksperimental, T. equi
terdeteksi tidak hanya di dalam darah tetapi juga di jaringan lain seperti
hati, limpa, paru-paru, dan sumsum tulang (Alhassan et al., 2007).
Posisi
taksonomi T. equi telah menjadi kontroversi akhir akhir ini telah diterangkan
ulang sebagai Theileria (Mehlhorn & Schein, 1998). Dukungan lebih lanjut
sebagai hubungan erat dengan Theileria spp. juga berasal dari homologi
ditemukan antara 30 dan 34 kDa protein permukaan T. equi dan protein berukuran
serupa berbagai Theileria spp. (Knowles et al., 1997).
Namun
demikian, posisi T. equi pada pohon filogenetik berdasarkan pada subunit kecil
gen RNA ribosom adalah variabel dan sebagian besar muncul sebagai keluarga
clade dari Theileria (Criado-Fornelio et al., 2003) sehingga menunjukkan bahwa
T. equi adalah leluhur ke Theilerids (Criado-Fornelio et al., 2003) atau kelompok
yang berbeda sama sekali (Allsopp et al., 1994). Penyelesaian T. equi genom
mendukung posisi filogenetik sebagai saudara takson untuk Theileria spp.
(Kappmeyer et al., 2012). Urut heterogenitas ada dalam kedua B. caballi dan T.
equi yang berpotensi berdampak pada interpretasi tes diagnostik molekuler.
Tanda-tanda
klinis equine piroplasmosis sering tidak spesifik, dan penyakit yang dapat
dengan mudah dibingungkan dengan kondisi lain. Piroplasmosis dapat terjadi
sebagai peracute, akut dan bentuk kronis. Kasus-kasus akut lebih umum, dan
ditandai dengan demam yang biasanya melebihi 40 °C, nafsu makan berkurang dan
malas, peningkatan pernapasan dan denyut nadi, kongesti membran mukosa, dan
bulatan feses yang lebih kecil dan lebih kering dari biasanya.
Tanda-tanda
klinis pada kasus subakut serupa. Selain itu, hewan yang terkena menunjukkan
hilangnya berat badan, dan demam kadang-kadang intermiten. Selaput lendir
bervariasi dari merah muda pucat hingga merah muda, atau kuning pucat hingga
kuning cerah. Petechiae dan / atau ekimosis juga dapat terlihat pada selaput
lendir. buang air besar yang normal mungkin sedikit tertekan dan hewan dapat
menunjukkan tanda-tanda kolik ringan. pembengkakan edema ringan bagian distal
dari tungkai kadang-kadang terjadi.
kasus-kasus
kronis biasanya menyajikan tanda-tanda klinis spesifik seperti inappetence
ringan, kinerja yang buruk dan penurunan massa tubuh. limpa biasanya ditemukan
membesar pada pemeriksaan rektal.
Bentuk
peracute langka di mana kuda ditemukan mati atau sekarat telah dilaporkan.
B.
TEKNIK DIAGNOSA
Table
1. Metode pengujian yang tersedia untuk diagnosta equine piroplasmosis dan
tujuanya
Metoda
|
Tujuan
|
||||||
Population bebas
dari infeksi
|
Individu bebas
dari infeksi
|
Contribusi pada kebijakan eradicasi
|
Konfirmasi
dari kasus klinis
|
Prevalensi dari infeksi - surveillance
|
Status Immune pada individu hewan dari populasi post-vaccinasi
|
||
Identifikasi
agen1
|
|||||||
Pengujian
Microscopik
|
-
|
+
|
-
|
++
|
+
|
n/a
|
|
PCR
|
+++
|
+++
|
+++
|
+++
|
+++
|
n/a
|
|
Deteksi respon immune
|
|||||||
IFAT
|
++
|
++
|
++
|
+++
|
++
|
n/a
|
|
C-ELISA
|
+++
|
+++
|
+++
|
+++
|
+++
|
n/a
|
|
CFT
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
n/a
|
|
Kunci:
+++
= metode yang direkomendasikan; ++ = Metode yang cocok; + = Dapat digunakan
dalam beberapa situasi, tetapi biaya, kehandalan, atau faktor-faktor lain sangat
membatasi penerapannya;
-
= Tidak sesuai untuk tujuan ini; n / a = tidak berlaku.
Meskipun
tidak semua uji terdaftar sebagai kategori +++ atau ++ telah menjalani validasi
formal, sifat rutin mereka dan fakta bahwa mereka telah digunakan secara luas tanpa
hasil yang meragukan, membuat mereka diterima.
PCR
= polymerase chain reaction; IFAT = indirect fluorescent antibody test;
C-ELISA
= competitive enzyme-linked immunosorbent assay; CFT = complement fixation
test.
1.
Identifikasi agen penyakit
Kuda
yang terinfeksi dapat diidentifikasi dengan ditemukannya parasit dalam
pewarnaan darah, secara optimal dikumpulkan dari kapiler kulit superfisial,
atau smear organ selama fase akut penyakit. metode pewarnaan tipe Romanovsky,
seperti metode Giemsa, biasanya memberikan hasil terbaik. Namun, bahkan dalam
kasus-kasus klinis akut infeksi B. caballi, parasitemia yang sangat rendah dan
sulit untuk dideteksi.
Pekerja
berpengalaman kadang-kadang menggunakan teknik apusan darah tebal untuk
mendeteksi parasitemia yang sangat rendah. Film tebal dibuat dengan menempatkan
setetes kecil (sekitar 50 µl) darah pada kaca obyek yang bersih, yang kemudian
dikeringkan, pada suhu pada 80 °C selama 5 menit, dan warnai dengan 5% Giemsa
untuk 20- 30 menit.
Identifikasi
akurat dari spesies parasit kadang-kadang diinginkan, infeksi campuran T. equi
dan B. caballi mungkin sering terjadi. Identifikasi equine piroplasmosis pada
hewan karier dengan pemeriksaan apus darah tidak hanya sangat sulit, tetapi
juga tidak akurat dan karena itu metode serologi lebih disukai (lihat di
bawah). Namun uji serologi, dapat memberikan reaksi negatif palsu atau positif
palsu (Tenter & Freidhoff, 1986).
Dalam
kasus tersebut, pasase dari seluruh darah ke kuda native atau makanan kutu pada
hewan tersangka telah diusulkan sebagai prosedur diagnostik tambahan. Namun,
teknik ini rumit, memakan waktu dan mahal. Selanjutnya dan penting, menyangkut
Animal welfare harus ditimbang terhadap kebutuhan informasi diagnostik.
Sukses
dalam pembentukan in-vitro kultur T. equi dan B. caballi mungkin menjadi salah
satu alternatif untuk melengkapi metode yang dijelaskan di atas, dalam rangka
untuk mengidentifikasi pembawa parasit. parasit Babesia caballi yang berhasil
dibiakkan dari darah dua kuda yang diuji negatif dengan tes fiksasi komplemen
(CF) (Holman et al., 1993). Demikian pula, T. equi bisa dibiakkan dari
kuda-kuda yang tidak menunjukkan parasitemia paten pada saat inisiasi kultur
(Zweygarth et al., 1997).
Teknik
molekuler untuk mendeteksi T. equi dan B. caballi telah dijelaskan. Metode ini
didasarkan pada reaksi berantai polimerase (polymerase chain reaction /PCR)
spesifik spesies, yang terutama menargetkan gen 18S rRNA (Criado- Fornelio et
al., 2003). perbaikan lebih lanjut untuk teknik termasuk nested-PCR (Rampersad
et al., 2003), loop- mediated isothermal amplification (LAMP) (Alhassan et al.,
2007) dengan melaporkan peningkatan sensitivitas, yang sangat sensitive Reverse
Line Blot assay (RLB) dan multipleks PCR untuk deteksi simultan dan
identifikasi spesies Theileria dan Babesia pada kuda (Alhassan et al., 2005).
Akuisisi genom T. equi memberikan kesempatan tambahan untuk meningkatkan dan
memperluas modalitas diagnostik untuk parasit ini (Kappmeyer et al., 2012).
______________
1 =
Kombinasi metode identifikasi agen diterapkan pada sampel klinis yang sama
adalah sangat dianjurkan.
2.
uji serologis
Adalah
sangat sulit untuk mendiagnosa organisme pada hewan karier dengan cara
pemeriksaan mikroskopis dari ulas darah. Selain itu, tidak ada artinya untuk
dilakukan dalam skala besar. Oleh karena itu pengujian serologis hewan
direkomendasikan sebagai metode yang disukai dari diagnosis, terutama ketika
kuda ditujukan untuk diimpor ke negara-negara di mana penyakit ini tidak
terjadi, tetapi ada vektornya.
Sera
harus dikumpulkan dan dikirim ke laboratorium diagnostik sesuai dengan
spesifikasi dari laboratorium itu. Kuda untuk ekspor yang telah mengalami tes
serologi dan terbukti bebas dari infeksi, harus bebas dari kutu untuk mencegah
kejadian infeksi.
Sejumlah
teknik serologi telah digunakan dalam diagnosis Piroplasmosis, seperti CFT, uji
indirect fluorescent antibody test (IFAT)) dan enzyme-linked immunosorbent
assay (ELISA). Selain itu, tes immunochromatographic sederhana dan cepat untuk
T. equi juga telah dijelaskan dan mungkin menjadi pengujian yang sangat berguna
untuk skrining massal sampel serum (Huang et al., 2004).
2.1. Uji Indirect fluorescent antibody
The IFAT
telah berhasil diaplikasikan pada diagnosis diferensial untuk infeksi T. equi
dan B. caballi. (Madden & Holbrook, 1968). Untuk mengetahui reaksi positif
yang kuat relatif sederhana, tetapi setiap perbedaan antara reaksi positif dan
negatif yang lemah membutuhkan pengalaman yang cukup dalam penafsiran.
Penjelasan
rinci tentang protokol dari IFAT telah diberikan (Madden & Holbrook, 1968).
Salah satu tantangan dengan IFAT adalah kebutuhan untuk larutan sera untuk
mengurangi ikatan non spesifik dan keadaan latar belakang, yang dapat
menghalangi identifikasi parasit intra-erytrhocytic. Pengenceran sera untuk
meningkatkan spesifisitas menyebabkan penurunan sensitivitas IFAT. Contoh dari
protokol IFA diberikan di bawah ini.
2.1.1.
Produksi antigen
Darah
untuk antigen diperoleh dari kuda dengan peningkatan parasitemia, idealnya
2-5%. hewan karier yang telah menghasilkan antibodi tidak cocok untuk produksi
antigen. Atau, kultur parasit in vitro dapat digunakan untuk persiapan slide
antigen untuk menghindari kontaminasi antibodi untuk sel darah merah yang
terinfeksi dan untuk pasokan konstan sel darah merah yang terinfeksi, terutama
untuk B. cabalii. Darah (sekitar 15 ml) dikumpulkan dalam 235 ml
phosphate-buffered saline (PBS), pH 7,2. Sel darah merah dicuci tiga kali dalam
PBS dingin (1000 g selama 10 menit pada suhu 4 °C).
Cairan
supernatan dan lapisan sel kulit putih dibuang setelah setiap pencucian.
Setelah pencucian terakhir, sel darah merah dikemas diencerkan dengan volume
awal dengan 4% fraksi V bovine serum albumin dibuat di PBS, yaitu asli volume
sel dikemas = 30% sehingga sepertiga terdiri dari sel darah merah. Jika volume
RBC asli 15 ml, kemudian 5 ml sel darah merah dikemas + 10 ml 4% bovine albumin
di dalam PBS antigen.
Setelah
pencampuran menyeluruh, antigen ditempatkan pada well yang siap pada slide kaca
menggunakan template atau jarum suntik. Atau, sel-sel dapat menyebar dengan
lancar ke mikroskop slide, meliputi seluruh slide dengan bahkan, film yang
cukup tebal. slide ini dibiarkan kering, dibungkus kertas lembut dan disegel
dalam kantong plastik atau dibungkus dalam aluminium foil, dan disimpan pada
suhu -20 °C hingga 1 tahun.
2.1.2.
Prosedur pengujian
i) Setiap
sampel serum diuji terhadap antigen B. caballi dan T. equi.
ii) Sebelum
menggunakan, slide antigen beku dikeluarkan dari penyimpanan pada -20 °C dan
diinkubasi pada 37 °C selama 10 menit.
iii)
Smears antigen kemudian dikeluarkan dari penyimpanan mereka dan pastikan tetap
pada aseton kering dingin (-20 °C) selama 1 menit. Slide dari produksen
komersial yang tersedia adalah yang pasti.
iv) Jika
Smear telah disiapkan pada seluruh permukaan slide, kotak (jumlahnya 14-21,
yaitu 2-3 baris dari 7 masing-masing) terbentuk pada smear antigen dengan cat
kuku atau pengeringan cepat setengah mounting (yaitu Cystoseal).
v) Uji,
positif dan negatif serum kontrol yang diencerkan dari 1/80 ke 1/1280 dalam
PBS. Negatif dan positif serum kontrol termasuk dalam setiap tes.
vi) Sera
diterapkan (10 µl masing-masing) pada pengenceran sesuai dengan well yang
berbeda atau kotak pada smear antigen, diinkubasi pada 37 °C selama 30 menit,
dan dicuci beberapa kali dalam PBS dan sekali di dalam air.
vii)
Immunoglobulin anti-kuda disiapkan pada kelinci dan dikonjugasi dengan
fluorescein isothiocyanate (konjugasi ini tersedia secara komersial) diencerkan
dalam PBS dan diaplikasikan pada smear, yang kemudian diinkubasi dan dicuci
seperti sebelumnya.
viii)
Setelah pencucian akhir, dua tetes larutan yang mengandung bagian yang sama
dari gliserin dan PBS ditempatkan pada setiap smear dan dipasang dengan
penutup-slip.
ix) Smear
tersebut kemudian diperiksa di bawah mikroskop untuk parasit fluoresens. Sera
diencerkan 1/80 atau lebih yang menunjukkan fluoresensi yang kuat biasanya
dianggap positif, meskipun pertimbangan juga diberikan kepada pola fluoresensi
dari kontrol positif dan negatif.
2.2.
Competitive enzyme-linked immunosorbent assay
Sejumlah
antigen rekombinan untuk digunakan dalam ELISA telah dijelaskan. Rekombinan T.
equi (EMA-1; EMA-2) dan B. protein caballi (RAP-1; Bc48) telah diproduksi di
Escherichia coli (Huang et al, 2003;. Kappmeyer et al, 1999;. Knowles et al.,
1992) atau dalam sel serangga dengan baculovirus (Xuan et al., 2001).
Antigen
rekombinan yang diproduksi di E. coli atau dengan baculovirus memiliki
keuntungan jelas menghindari kebutuhan untuk menginfeksi kuda untuk produksi
antigen, dan menghilangkan reaksi silang dari berpengalaman di masa lalu dengan
antigen crude ELISA. Mereka juga menyediakan sumber yang konsisten dari antigen
untuk distribusi internasional dan standarisasi.
Indirect
ELISA menggunakan EMA-2 dan BC48 telah menunjukkan sensitivitas dan
spesifisitas yang tinggi dalam mendeteksi antibodi pada kuda yang terinfeksi
(Huang et al, 2003;. Ikadai et al, 1999.). Hasil awal dari uji ini menjanjikan
dan merupakan validasi lebih lanjut dari tes sedang berlangsung.
Inhibisi
kompetitif ELISA (C-ELISA) menggunakan protein EMA-1 dan antibodi monoklonal
spesifik (MAb) yang mendefinisikan epitop protein merozoit permukaan, telah
digunakan dalam C-ELISA untuk T. equi (Knowles et al., 1992). Ini C-ELISA
mengatasi masalah kemurnian antigen, sebagai kekhususan pengujian ini hanya
bergantung pada kekhususan yang didefinisikan oleh MAb T. equi epitop. Korelasi
94% ditunjukkan antara C-ELISA dan CFT dalam mendeteksi antibodi terhadap T.
equi. Sera yang memberi hasil discrepant dievaluasi karena kemampuan mereka
untuk immunopresipitasi 35S-metionin-label produk in-vitro dari T. equi
merozoit mRNA. Sampel yang dimana C-ELISA positif dan CFT negatif jelas
diendapkan beberapa protein T. equi. Namun, immunopresipitasi hasil dengan sampel
serum dimana yang C-ELISA negatif dan CFT positif tidak meyakinkan (Knowles et
al., 1991).
C-ELISA
ini untuk T. equi juga divalidasi di Maroko dan Israel, memberikan konkordansi
dari 91% dan 95,7% dengan IFAT, masing-masing (Rhalem et al, 2001;. Shkap et
al., 1998). A setara C-ELISA telah dikembangkan menggunakan rekombinan B.
caballi rhoptry-terkait protein 1 (RAP-1) dan reaktif MAb dengan epitop peptida
dari kDa antigen 60 B. caballi (Kappmeyer et al., 1999).
Hasil
dari 302 sampel serum diuji dengan ini C-ELISA dan CFT menunjukkan 73%
konkordansi. Dari 72 sampel yang dimana CFT negatif dan C-ELISA positif, 48
(67%) yang terbukti positif pada IFAT, sementara empat dari lima sampel yang
diuji CFT positif dan C-ELISA negatif positif pada IFAT (Kappmeyer et al.,
1999).
Sebuah
uji protokol untuk Piroplasmosis kuda C-ELISA telah dijelaskan dan digunakan
untuk studi validasi tambahan (Departemen Pertanian Amerika Serikat [USDA],
2005). Kekhususan jelas dari T. equi. dan B. caballi C-ELISA di antara 99,2% dan
99,5% menggunakan serum dari 1.000 kuda diduga bebas dari Piroplasmosis. Seribu
kuda asing dari status infeksi tidak diketahui diuji oleh C-ELISA dan CFT
dengan sensitivitas yang lebih besar dari C-ELISA. Hasilnya adalah 1,1% (T.
equi) dan 1,3% (B. caballi) hewan lebih seropositif terdeteksi oleh C-ELISA
dari oleh CFT; hasil positif tambahan dikonfirmasi oleh IFAT.
Sebuah
studi serupa dari 645 kuda asal asing diuji untuk tujuan impor dan pra-impor
menggunakan perlakuan panas sera (58 °C selama 30 menit), dan mengakibatkan
3,6% (T. equi) dan 2,1% (B. caballi) lebih hewan seropositif terdeteksi oleh
C-ELISA daripada CFT tersebut. Kedua C-ELISA yang sangat direproduksi dengan
well ke well, plate ke plate, dan sehari-hari, dengan variasi keseluruhan ± 1,2%
dan ± 1,6% untuk masing-masing T. equi dan uji B. caballi.
Protokol
C-ELISA diberikan di bawah ini.
Sebuah
penjelasan rinci tentang produksi antigen dan tes protokol telah diberikan oleh
National Veterinary Services Laboratories (NVSL) dari USDA (2005). Sebuah kit
komersial yang sekarang tersedia yang didasarkan pada antigen yang sama dan
antibodi monoklonal).
2.2.1.
Larutan
i) Antigen
lapisan penyangga
Siapkan
volume antigen-lapisan penyangga yang diperlukan menggunakan jumlah bahan
berikut per liter: 2,93 g natrium bikarbonat; 1.59 g natrium karbonat; air
murni ultra cukup untuk melarutkan, dan membuat hingga 1 liter dengan air
ultra-murni. Sesuaikan dengan pH 9,6.
ii)
Laruran pencuci C-ELISA (pengencer garam tinggi)
Siapkan
volume larutan pencuci dari C-ELISA diperlukan dengan menggunakan jumlah
berikut bahan per liter: 29,5 g natrium klorida; 0,22 g monobasa natrium
fosfat; 1,19 g dibasic sodium fosfat; 2,0 ml Tween 20; air ultra-murni cukup
untuk melarutkan, dan membuat hingga 1 liter dengan air ultra-murni. Campur
dengan baik. Menyesuaikan pH 7,4. Sterilkan dengan autoklaf pada 121 ° C.
2.2.2.
Produksi antigen
Kultur E. coli berubah beku diinokulasi pada
1/10.000 pengenceran ke dalam setiap standar non selektif kaldu pertumbuhan
bakteri (misalnya Luria broth) yang mengandung menambahkan karbenisilin (100
ug/ml) dan isopropil-thiogalactoside (IPTG, 1 mM).
Kultur
diinkubasi pada pengaduk orbital disetel pada 200 rpm pada suhu 37 °C semalam.
Sel tumbuh semalam dipanen dengan sentrifugasi (5000 g selama 10 menit), dicuci
di 50 mM Tris/HCl dan penyangga 5 m asam etilen diamin tetra-asetat (ethylene
diamine tetra-acetic acid /EDTA), pH 8,0, dan dipanen lagi seperti sebelumnya.
(Antigen tersedia dari NVSL, Kotak Pos 844, Ames, Iowa 50010, USA.)
Sel
diresuspensi sampai 10% dari volume asli dalam penyangga Tris/EDTA ke yang 1 mg/ml lisozim telah
ditambahkan, dan diinkubasi pada es selama 20 menit. Nonidet P-40 deterjen
(NP-40) kemudian ditambahkan dengan konsentrasi akhir 1% (v/v), vortex, dan
campuran diinkubasi pada es selama 10 menit.
Materi
yang selanjutnya disonikasi empat kali selama 30 detik setiap kali di 100 watt,
di atas es, memungkinkan 2 menit antara sonikasi untuk bahan untuk tetap
dingin. Sonikan tersebut disentrifugasi pada 10.000 g selama 20 menit.
Supernatan
yang dihasilkan dibagikan dalam 0,5 ml aliquot dalam tabung microcentrifus dan
kemudian dapat disimpan pada suhu -70 ° C selama beberapa tahun. Kehadiran
hospes antigen bakteri heterolog tidak mengganggu pengikatan antibodi
anti-piroplasma spesifik kuda atau pengikatan MAbs dipasangkan ke masing epitop
antigen rekombinan mereka, dan dikonfirmasi oleh prosedur berikut.
Antigen
yang mengandung supernatan adalah control kualitas dengan titrasi mereka dengan
pasangan MAbs dan dengan mengacu monospecific antisera kuda untuk memverifikasi
kedua tingkat yang memadai dari ekspresi dan spesifisitas lengkap untuk spesies
homolog agen Piroplasmosis. serum yang normal (serum negatif) kontrol tidak
harus mengganggu pengikatan MAbs atau sera referensi kuda positif untuk
mempercepat persiapan antigen.
2.2.3.
Prosedur pengujian
i) Plate
mikrotitrasi disusun dengan melapisi well dengan 50 µl antigen T. equi atau antigen B. caballi
dengan diencerkan dalam buffer antigen-coating. Pengenceran digunakan
ditentukan dengan standar teknik titrasi serologis. Pelat tersebut disegel
dengan pita penyegelan, disimpan semalam pada suhu 4 °C, dan dibekukan pada
suhu -70 °C. Pelat dapat disimpan pada suhu -70 °C hingga 6 bulan.
ii) Primer
anti-T. equi atau anti-B. caballi MAb dan konjugat antibodi-peroksidase
sekunder diencerkan seperti yang diarahkan oleh produsen pada saat digunakan
dalam C-ELISA, dengan penyangga antibodi-diluting (disertakan dengan test kit).
iii)
Pelat dicairkan pada suhu kamar, larutan pelapis dialirkan, dan piring dicuci dua
kali dengan C-ELISA larutan pencuci.
iv) Kontrol
serum dan uji sampel serum diencerkan 1/2 dengan serum-diluting buffer sebelum
50 µl sera ditambahkan ke well. Setiap sampel serum yang tidak diketahui diuji
di well tunggal atau ganda. serum kontrol positif dan blank diuji ganda
sementara kontrol negatif diuji dalam tiga ganda pada bagian yang berbeda dari
well.
Pelat
diinkubasi tertutup, pada suhu kamar (21-25 °C) selama 30 menit di ruang
lembab, dan kemudian dicuci tiga kali di pelarut pencuci C-ELISA.
v) Semua
well kemudian menerima 50 µl/well dari pengenceran primer anti-T. equi atau
anti-B. caballi MAb. (MAb diproduksi dalam bioreaktor kultur sel dan tersedia
dari NVSL, PO Box 844, Ames, Iowa 50010, USA.) Pelat diinkubasi tertutup selama
30 menit pada suhu kamar (21-25 °C) dalam ruang lembab , dan kemudian dicuci
tiga kali dalam pelarut pencuci C-ELISA.
vi) Pengenceran
sekunder konjugat anti-murine peroksidase IgG (50 µl/well) ditambahkan ke
masing-masing setiap well. Pelat diinkubasi tertutup selama 30 menit pada suhu
kamar (21-25 °C) dalam ruang lembab, dan kemudian dicuci tiga kali dalam
pelarut pencuci C-ELISA.
vii)
Substrat enzim Chromogenic (50 µl/well) ditambahkan ke semua well, dan pelat
diinkubasi selama 15 menit pada suhu kamar (21-25 °C) selama perkembangan
warna.
viii)
Perkembangan warna dihentikan dengan menambahkan 50 µl larutan stop untuk semua
well dan pelat dibaca langsung pada pelat rider.
ix) Pelat
dibaca pada 620, 630 atau 650 nm panjang gelombang (OD). Rata-rata OD dihitung
untuk duplikat well untuk semua serum kontrol dan well kosong. Untuk uji valid,
rata rata (Mean) dari kontrol negatif harus menghasilkan OD >0.300 dan
<2.000. Rata rata (mean) serum kontrol positif harus menghasilkan
penghambatan 40%.
x) Persentase
penghambatan [% I] dihitung sebagai berikut:% I = 100 - [(sampel OD x 100) +
(Mean kontrol OD negatif)].
xi) Jika
sampel uji menghasilkan 40% penghambatan itu dianggap positif. Jika sampel uji
menghasilkan <40% penghambatan itu dianggap negatif.
2.3.
Uji Complement fixation test
CFT
yang telah digunakan di masa lalu oleh beberapa negara dan masih banyak
digunakan di beberapa daerah untuk memenuhi syarat importasi kuda. Sebuah
penjelasan rinci tentang produksi antigen dan protocol uji telah diberikan
(misalnya: USDA, 1997).
CFT
adalah akurat untuk mendeteksi dini (akut) infeksi saja, dimana tujuan itu
menunjukkan sensitivitas yang baik dan spesifisitas, tetapi mungkin tidak
mengidentifikasi semua hewan yang terinfeksi, terutama mereka yang telah diobati
atau yang menghasilkan reaksi anti-komplementer, atau karena ketidakmampuan IgG
(T) (imunoglobulin isotipe utama equidae) untuk menetapkan komplemen hamster.
Antigen
untuk CFT dibuat oleh infeksi eksperimental dari kuda, ini menimbulkan
kekhawatiran mengenai animal welfare. Oleh karena itu, ada kemungkinan bahwa
CFT akan dihentikan di masa depan; IFAT dan C-ELISA telah mengganti sebagai tes
yang ditentukan untuk perdagangan internasional.
Contoh
dari protokol CFT diberikan di bawah ini.
2.3.1.
Larutan
i) larutan
Alsever
Siapkan
1 liter larutan Alsever ini dengan melarutkan 20,5 g glukosa; 8,0 g natrium
sitrat; 4,2 g natrium klorida dalam air suling yang cukup. Sesuaikan sehingga
pH 6,1 menggunakan asam sitrat, dan buat volume menjadi 1 liter dengan air
suling. Disterilkan dengan filtrasi.
ii) Buffer
Stock veronal (5x)
Larutkan
berikut dalam 1 liter air suling: 85,0 g natrium klorida; 3,75 g natrium 5,5
dietil barbiturat; 1,68 g magnesium klorida (MgCl2.6H20); 0,28 g kalsium
klorida. Larutkan 5,75 g asam dietil barbiturat 5,5 di 0,5 liter air suling
panas (dekat mendidih).
Dinginkan
larutan asam ini dan tambah larutan garam. Buat untuk 2 liter dengan air suling
dan simpan pada suhu 4 °C. Untuk mempersiapkan pengenceran bekerja, tambahkan
larutan stok satu bagian ke empat bagian air suling. PH akhir harus 7,4-7,6.
2.3.2.
Produksi antigen
Darah
diperoleh dari kuda dengan parasitemia tinggi (mis 3-7% parasitemia untuk B.
caballi dan 60-85% untuk T. equi), dan dicampur dengan volume yang sama dari larutan
Alsever sebagai antikoagulan. Plasma /Alsever ini supernatan dan buffy coat
dibuang ketika sel darah merah telah menetap ke bagian bawah labu. Sel darah
merah dicuci beberapa kali dengan buffer Veronal dingin dan kemudian pisahkan.
Antigen pulih dari lisis dengan sentrifugasi pada 30.900 g selama 30 menit.
Antigen
rekoveri dicuci beberapa kali dalam penyangga Veronal dingin dengan
sentrifugasi pada 20.000 g selama 15 menit. Polivinilpirolidon 40.000 (1-5%
[w/v]) ditambahkan sebagai stabilisator dan persiapan dicampur pada pengaduk
magnetik selama 30 menit, disaring melalui dua ketebalan kasa steril, dibagikan
ke dalam volume 2 ml dan beku-kering. antigen kemudian dapat disimpan pada suhu
di bawah -50 °C selama beberapa tahun.
2.3.3.
Prosedur pengujian
i) Kekhasan
dan potensi setiap batch antigen harus diperiksa terhadap antisera standar
diketahui kekhususan dan potensinya. pengenceran antigen yang optimal juga
ditentukan dalam kotak-kotak titrasi awal.
ii) Uji
sera yang tidak aktif selama 30 menit pada 58 °C (sera keledai dan bagal yang
tidak aktif pada suhu 62.5 ° C selama 35 menit) dan diuji di pengenceran 1/5
samapai 1/5120. Penyangga Veronal digunakan untuk semua pengenceran.
iii)
Komplemen disiapkan dan dititrasi spektrofotometrinya untuk menentukan 50 %
dosis hemolitik (C'H50) (Stiller et al., 1980) dan digunakan dalam tes di lima
kali C'H50. Sistem hemolitik terdiri dari bagian yang sama dari suspensi 2%
domba (RBC) dan penyangga Veronal dengan 5 dosis minimum hemolitik (MHDs) dari
hemolisin (amboceptor) (USDA, 1997). Beberapa laboratorium menggunakan dua kali
dosis hemolitik 100%, yang memberikan sensitivitas setara.
iv) Uji
telah disesuaikan dengan pelat mikrotitrasi (Herr et al., 1985). Total volume
dari tes ini adalah 0,125 ml, terdiri dari bagian yang sama (0,025 ml) dari
antigen, pelengkap (lima kali C'H50) dan serum diencerkan. Inkubasi dilakukan
selama 1 jam pada suhu 37 °C.
v) Porsi
ganda (0,05 ml) dari sistem hemolitik ditambahkan dan plate diinkubasi lagi
selama 45 menit pada suhu 37 ° C dengan pengocok (shaker) setelah 20 menit.
vi) Plate
disentrifugasi selama 1 menit pada 200 g sebelum membacanya melalui cermin.
vii)
Yang lisis 50% dicatat sebagai positif, dengan titer yang menjadi larutan serum
terbesar memberikan lysis 50%. Titer 1/5 dianggap sebagai positif. Sebuah set
lengkap kontrol (sera positif dan negatif) harus disertakan dalam setiap uji
serta antigen kontrol dibuat dari normal (tidak terinfeksi) sel darah merah kuda.
Sampel
Antikomplementer diperiksa dengan IFAT. Sera keledai sera sering kali
anti-complementary.
C.
PERSYARATAN VAKSIN
Tidak
ada vaksin yang tersedia saat ini.
D.
DAFTAR PUSTAKA
Ada
pada Penyadur/Penulis
Oleh
drh Giyono Trisnadi,
Diterjemahkan
/Disadur dari Naskah Asli:
EQUINE
PIROPLASMOSIS
by
OIE, CHAPTER 2.5.8 OIE Terrestrial Manual 2016.
NB:
Version Adopted by The world Assembly of Delegates of The OIE in May 2014