Pakan
ternak adalah bahan penting sebagai bagian pada komponen dalam dunia peternakan. Kwalitas pakan akan sangat mempemgaruhi keberhasilan Peternakan. Makalah hasil
terjemahan ini ditulis oleh drh. Dede Sriwahyuni MSi, Medik Veteriner Muda pada Pusat Karantina Hewan dan Keamanan Hayati Hewani, Badan Karantina
Pertanian.
******
JAMINAN
KUALITAS ANALISIS LABORATORIUM MIKROBIOLOGI PADA PAKAN
(Terjemahan)
Oleh:
Dede
Sri Wahyuni
(Tulisan
asli: Quality assurance for microbiology in feed analysis laboratories, by R.A.
Cowie. Edited by Harinder P.S. Makkar. FAO Animal Production and Health Manual
No. 16. Rome. FAO. 2013. “Isolation of Salmonella spp. from animal feed samples”:
page143, “Isolation of Listeria spp.
from animal feed samples”: 149. “Detection of Trichinella spp. in animal feed
samples”: page: 183).
FAO
ANIMAL PRODUCTION AND HEALTH, MANUAL
Yang
dipergunakan dan dipresentasikan pada materi mengenai informasi produk ini
tidak mewakili pengekspresian opini apapun dari pihak Food and Agriculture
Organization (FAO) Perserikatan Bangsa-Bangsa mengenai status hukum atau
pengembangan dari setiap negara, wilayah, kota atau daerah atau otoritasnya,
atau mengenai batas-batas wilayah atau perbatasan. Penyebutan perusahaan
tertentu atau produk dari produsen, baik sudah atau belum dipatenkan, tidak
berarti produk ini didukung atau direkomendasikan oleh FAO dalam preferensi
seperti produk lain yang tidak disebutkan namun memiliki sifat sama.
Berbagia
pendapat yang diungkapkan dalam informasi ini merupakan cerminan pandangan dari
penulis dan tidak mencerminkan pendapat atau kebijakan dari FAO. ISBN
978-92-5-107656-9 (print) E-ISBN
978-92-5-107657-6 (PDF) ©
FAO 2013
FAO
mendukung penggunaan, reproduksi dan penyebarluasan bahan dalam produk
informasi ini. Kecuali jika ada ketentuan lain dinyatakan, materi dapat
disalin, didownload dan dicetak untuk dipelajari secara pribadi, untuk tujuan
penelitian dan mengajar, atau untuk digunakan dalam produk non-komersial atau
pelayanan, dengan catatan mencantumkan FAO sebagai sumber dan pemegang hak
cipta serta tidak mengimplikasikan dukungan FAO terhadap pandangan pengguna,
produk atau jasa dengan cara apapun. Semua
hak cipta atas permintaan untuk terjemahan dan diadaptasi, dan untuk dijual
kembali serta hak penggunaan komersial lainnya harus meminta izin melalui
www.fao.org/contact-us/licence-request atau ditujukan kepada copyright@fao.org.
Manual
informasi FAO tersedia di situs web FAO (www.fao.org/publications) dan dapat
dibeli melalui publications-sales@fao.org.
Isolasi
Salmonella spp. dari sampel pakan ternak
Isolasi
Listeria spp. dari sampel pakan ternak
Deteksi
Trichinella spp. dalam sampel pakan ternak
******
ISOLASI
SALMONELLA SPP. DARI SAMPEL PAKAN TERNAK
Prinsip
dan Ruang Lingkup
Salmonella
adalah spesies yang ditemukan paling banyak di saluran pencernaan hewan.
Salmonella merupakan pathogen pada hewan dan manusia. Bahan makanan yang
terkontaminasi dengan kotoran hewan merupakan sarana penting dalam penularan
infeksi. Pakan ternak diperkirakan menjadi sumber penting dari infeksi
Salmonella akibat kontaminasi feses (terutama di pakan ternak yang mengandung
darah, tulang, tepung ikan atau bahan pakan asal tumbuhan yang kaya protein
seperti oil seed meals). Di beberapa Negara di dunia kotoran unggas dapat
digunakan sebagai pakan untuk ternak ruminansia. Bakteri ini juga dapat
menyebar melalui kotoran unggas yang digunakan sebagai pupuk. Kehadiran
Salmonella pada pakan ternak dapat menyebabkan infeksi pada hewan.
Spesies
Salmonella diklasifikasikan dan diidentifikasi dalam serotipe sesuai dengan
skema White-Kauffmann-Le memiliki lebih dari 2600 serotipe. Salmonella memiliki 3 macam antigen, yaitu Ag simatik (O),
Ag flagell (H) yang berbeda satu/dua fase dan Ag kapsul (Vi). Ag O dan Ag H
adalah antigen utama Salmonella. Bakteri Salmonella membentuk Ag (O) dan AG (H)
yang termostabil. Antigen (O) dikode dengan angka Romawi (I, II dan
sebagainya). Antigen yang dihubungkan dengan sifat virulensi S. typhi diberi
kode Vi, Antigen ini tidak tahan panas.
Alat:
-Timbangan
-Inkubator
suhu 37 ± 1°C
-Inkubator
suhu 41.5 ± 1°C.
-Kulkas
di 2-8°C (untuk penyimpanan sampel).
-Loop
steril (10 μl and 1μl).
-Cawan
petri 90 mm steril.
-Gelas
objek.
Bahan:
-Buffered
peptone water (BPW) 90 mL dan BPW volume 225 mL (termasuk double BPW jika
diperlukan).
-Media
Rappaport-Vassiliadis (RVS broth).
-Muller-Kauffman
Tetrathionate-Novobiocin broth (MKTTn).
-Media
Xylose Lysine Deoxycholate (XLD).
-Media
solid selektif lain untuk pertumbuhan Salmonella yang mengandung XLD*.
-Nutrient
agar.
-Salmonella
monovalent dan polyvalent agglutinating antiserum (sesuai kebutuhan).
-Sistem
identifikasi mikrobiologi Komersial (Misalnya API™ atau yang sejenis).
-Kultur
Salmonella standar (Misalnya NCTC or ATCC) sebagai kontrol positif.
-Saline.
Cara
Kerja:
Manajemen
Sampel
Pengujian
dilakukan ketika sampel tiba di laboratorium. Jika pengujian tidak dapat
dilakukan pada hari penerimaan, sampel harus disimpan pada suhu 2-8°C sampai
dilakukan pengujian. Jika pengujian akan dilakukan, sampel harus dikeluarkan
dari kulkas dan disimpan pada suhu kamar selama minimal satu jam sebelum
dimulainya pengujian.
Hari
ke-1
-Timbang
secara aseptik 25 ± 0,2 g (atau 25 ± 0,2 ml untuk sampel cair) masing-masing
sampel pakan dan tambahkan 225 mL Buffered Peptone Water (BPW). BPW dapat
digunakan sebagai kontrol negatif dan media biakan standar (misalnya NCTC,
ATCC) dapat digunakan sebagai kontrol positif. Perbandingan akhir sampel
terhadap BPW harus 01:10 dan dapat disesuaikan jika sampel mencukupi.
-Apabila
pakan yang digunakan ringan (misalnya jerami) atau bahan pakan yang mengembang
(misalnya produk biji line) jumlah sampel dapat dikurangi (misalnya untuk 10 g)
disesuaikan dengan kebutuhan, sehingga berat total sampel yang dapat diambil
sesuai dengan 225 mL BPW.
-Untuk
bahan pakan yang bersifat asam atau yang diasamkan (misalnya silase) BPW yang
digunakan dapat digandakan untuk memastikan bahwa pH tidak di bawah pH 4,5.
-Inkubasi
pada suhu 37 ± 1°C selama 18 ± 2 jam.
Hari
ke-2
-Ambil
100 ml dari masing-masing larutan BPW dan sampel secara aseptik dan
inokulasikan ke dalam 10 mL media Rappaport-Vassiliadis (RVS broth).
-Larutan
100 ml yang diinokulasikan sebaiknya dekat dengan permukaan, agar endapan pakan
tidak terbawa.
-Inkubasi
RVS broth pada suhu 41,5 ± 1°C selama 24 ± 3 jam.
-Ambil
1.000 µl larutan BPW dan RVS dan inokulasikan ke dalam 10 mL Muller-Kauffman
Tetrathionate-Novobiocin broth (MKTTn).
-Larutan
1.000 µl yang diinokulasikan sebaiknya dekat dengan permukaan, agar endapan
pakan tidak terbawa.
-Inkubasi
MKTTn broth pada suhu 37 ± 1°C selama 24 ± 3 jam.
Hari
ke-3
-Inokulasikan
10 µl RVS broth dan MKTTn broth ke dalam 4 plate media agar selektif dengan
menggunakan loop mikrobiologi. Dua plate
merupakan Xylose Lysine Deoxycholate (XLD) dan dua plate dengan media padat
selektif yang terdapat XLD. Setiap sampel menggunakan loop yang berbeda.
-Inkubasi
empat plate pada suhu 37 ± 1°C selama 24 ± 3 jam.
-Jika
setelah 24 ± 3 jam pada suhu 37 ± 1°C plate hasilnya negatif, atau hanya
terdapat koloni yang sangat kecil, inkubasikan kembali plate pada 37 ± 1°C
selama lebih 24 ± 3 jam.
Hari
Ke-4 (atau Hari ke-5 jika plate diinkubasi lagi selama 24 ± 3 jam pada Hari 3)
-Periksa
plate. Subkultur kecil pada tiga koloni dari setiap plate yang dicurigai
sebagai Salmonella ditumbuhkan ke Nutrient Agar dan diinkubasi pada suhu 37 ±
1°C selama semalam. Salmonella biasanya menghasilkan koloni dengan bagian
tengah berwarna hitam (karena produksi H2S) dan zona yang sedikit transparan
warna kemerahan, meskipun strain laktosa positif menghasilkan koloni yang
berwarna kuning, baik dengan atau tanpa bagian tengah yang menghitam. Beberapa
serovar misalnya Salmonella paratyphi A (serotipe pada manusia) atau Salmonella
Senftenberg dengan H2S negatif sehingga tidak ada bagian koloni yang hitam.
Catatan:
Koloni dari media selektif dapat mengandung sedikit koloni kontaminan tetapi
pertumbuhan akan terhambat pada saat subkultur dan menyebabkan reaksi biokimia
yang salah.
Hari
5 (atau Hari 6 jika plate diinkubasi kembali selama 24 ± 3 jam pada Hari 3)
-Jika
setelah inkubasi semalam kemurnian plate menunjukkan pertumbuhan koloni murni,
isolat suspect diuji menggunakan sistem identifikasi mikrobiologi komersial
(misalnya API™ atau yang sejenis) untuk mengkonfirmasi karakterisasi biokimia
Salmonella spp.
-Lakukan
uji aglutinasi dengan antisera, sesuai dengan intruksi pabrik. Reaksi antisera
harus diamati dengan pengemulsi single, koloni terisolasi yang tumbuh baik pada
Nutrient Agar dicampurkan ke dalam gelas objek. Antisera 'O' menghasilkan
reaksi aglutinasi granular pada gelas objek. Antisera 'H' menghasilkan
aglutinasi floccular pada gelas objek. Antigen 'Vi' biasa ada dan menutupi
antigen 'O' serta menyebabkan bakteri tidak mengaglutinasi antisera 'O'.
-Lakukan
pemeriksaan untuk auto aglutinasi dengan pengemulsi single, koloni terisolasi
yang tumbuh baik pada Nutrient Agar campurkan dengan satu tetes saline (NaCl
0,85%) dan amati granulasinya. Aglutinasi positif menunjukkan bahwa strain
tidak dapat diidentifikasi serotipenya.
-Identifikasi
serologis kompleks dapat dilakukan dengan menggunakan polivalen antisera yang
mengandung pool (misalnya OMA dan OMB). Jika strain menunjukkan hasil positif,
dapat diuji dengan komponen pool.
-Untuk
mengidentifikasi Salmonella dalam Grup B, C, D, E atau G menggunakan cakupan
antisera yang terbatas O dengan serotipe lanjut dilakukan dengan menggunakan koleksi
laboratorium.
-Jika
pertumbuhan koloni dalam plate tidak murni, ulangi tes biokimia dan
agglutinations slide dari koloni Salmonella pada koloni murni.
-Cawan
petri set kedua diinokulasikan pada plate BGA diperiksa dengan mengikuti
prosedur yang sama.
-Dimana
kedua can petri set BGA tidak ada koloni yang tumbuh hasilnya dapat dilaporkan.
Hari
ke-6
-Sistem
Identifikasi mikrobiologi (misalnya API™ atau serupa) dibaca dan hasil uji
biokimia digunakan untuk mengkonfirmasi Salmonella spp.
Untuk
control media MSRV referensi yang sesuai dengan strain Salmonella harus
diinokulasi pada 104 CFU/0,1 mL sebagai kontrol positif dan strain yang sesuai
dari organisme non target (misalnya E. coli atau E. faecalis) diinokulasi pada
105-106 CFU/0,1 mL.
DAFTAR
PUSTAKA
ISO
6579:2002. Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal method
for the detection of Salmonella species. Geneva, Switzerland.
HPA.
2011. UK standards for microbiology investigations: Identification of
Salmonella species. HPA Bacteriology identification ID 24 Issue No 2.2, October
2011. London, UK.
VDLUFA.
2012. Methods book III 8th Supplement 2012, No 28.3.1. Detection of Salmonella.
Speyer, Germany.
******
ISOLASI
LISTERIA SPP. DARI SAMPEL PAKAN TERNAK
Prinsip
dan ruang lingkup
Listeria
spp. tidak berspora, pendek (dengan panjang 0,5-2,0 µm), batang Gram positif
yang tersebar luas di lingkungan dan dapat diisolasi dari produk hewan, tanah,
sayuran, makanan, silase dan pakan hewan. Listeria spp. patogen baik pada hewan
dan manusia serta dapat mengkontaminasi bahan pakan dengan kotoran hewan.
Kontaminasi pakan merupakan sarana penting dalam penularan infeksi. Silase
umumnya terlibat dalam wabah Listeriosis pada hewan ternak.
spp.
dapat dibagi menjadi sepuluh spesies:
-L.
murrayi dan L. grayi non-hemolitik dan jarang dapat diisolasi. Keduanya
dianggap non patogen.
-L.
monocytogenes dan L. ivanovii yang hemolitik dan patogen bagi manusia dan
hewan.
-L.
seeligeri juga hemolitik tetapi dianggap tidak patogen.
-L.
innocua dan L. welshimeri non hemolitik dan dianggap tidak patogen.
-L.
fleischmannii, L. marthii dan L. rocourtiae spesies yang baru ditemukan dengan
patogenitas yang belum diketahui.
Kesehatan
dan Keselamatan
Listeria
spp. bersifat zoonosis sehingga harus menggunakan laboratorium BSL 2. Listeria
spp. dapat menyebabkan infeksi berat dan aborsi pada individu yang terinfeksi.
Dengan demikian, laboran hamil dan individu dengan imun rendah dilarang bekerja
dengan media yang diduga mengandung Listeria spp.
Alat:
-Seal
plastik steril.
-Timbangan.
-Inkubator
dengan suhu 30 ± 2°C (dan 37 ± 1°C untuk tes CAPM).
-Stomacher.
-Kulkas
dengan suhu 2-8°C (untuk penyimpanan sampel).
-Loop
steril (10 ml).
-Bakteri
koleksi untuk kontrol (misalnya NCTC atau ATCC).
Bahan:
-Media
Listeria agar selektif (mengandung Aesculin).
-Agar
darah (5%).
-Listeria
Enrichment Broth (formulasi UVM).
-Sistem
identifikasi mikrobiologi Komersial (misalnya API).
-Antiserum
Listeria polivalen O.
-D-xylose
fermentation broth.
-L-rhamnose
fermentation broth. Nitrate reduction broth (also sulfanilic acid,
N,N-dimethyl-1-naphthylamine dan zinc powder).
-Saline.
Metode
Manajemen
sampel
Sampel
diuji setibanya di laboratorium. Jika pengujian tidak dapat dilakukan pada hari
penerimaan sampel, sampel harus disimpan pada suhu 2-8°C. Jika akan dilakukan
pemeriksaan, sampel disimpan di suhu kamar minimal satu jam sebelum dimulainya
pengujian. Listeria spp. ditumbuhkan pada media Listeria Agar Selektif
(mengandung Aesculin) sebagai koloni hitam dengan dikeliling zona coklat
gelap/zona hitam yang dihasilkan oleh hidrolisis Aesculin. Untuk mengisolasi
Listeria dari sampel pakan ternak sampel harus dihomogenkan dan diinkubasi
dalam Listeria Enrichment Broth sebelum Enrichment sekunder dan ditumbuhkan
pada media selektif.
-Tempatkan
25 ± 1,0 g sampel dengan menggunakan plastik steril secara aseptik pada
stomacher steril. Pastikan plastik tertutup atau menggunakan platik double.
-Tambahkan
225 ± 5 ml (atau 225 ± 5 g) Listeria Enrichment Broth (formulasi UVM) pada
sampel campuran pada stomacher selama kurang lebih 2 menit serta pindahkan
campuran homogeny ke dalam wadah steril. Inkubasi pada suhu 30 ± 2°C selama 48
± 4 jam.
-Kultur
standar Listeria (misalnya NCTC atau ATCC) harus diinokulasi ke dalam 225 mL
Listeria Enrichment Broth sebagai kontrol positif. Listeria diinokulasi dalam
Enrichment Broth digunakan sebagai kontrol negatif.
-Dengan
menggunakan ose (loop) streak koloni yang berumur dua hari di enrichment broth
ke dalam media selektif agar Listeria (mengandung Aesculin) dengan pola zigzag.
Diameter ose antara 0,5 sampai 1 cm. inkubasi plate media selektif agar
Listeria pada suhu 30 ± 2°C selama 24-48 jam.
-Amati
kemurnian koloni dan morfologi koloni dalam cawan petri. Biakan koloni sub
kultur yang diduga Listeria ke dalam ke 5% agar darah dan inkubasi pada suhu 37
± 1°C selama 24-48 jam.
-Konfirmasi
genus Listeria.
-Dari
plate agar darah, lakukan uji tes katalase (sebagian besar strain positif) dari
koloni tunggal dan Gram stain (Gram positif batang) pada koloni tunggal.
Pengujian untuk aglutinasi dengan antisera Listeria polivalen O.
Kultur
standar (misalnya NCTC atau ATCC) harus digunakan sebagai kontrol positif dan
negatif untuk uji katalase dan aglutinasi dengan antisera Listeria polivalen.
Lakukan
uji auto aglutinasi dengan pengemulsi single, koloni tunggal yanng tumbuh baik
pada agar darah ditambahkan setetes saline (NaCl 0,85%) dan amati granulasinya.
Auto aglutinasi positif menunjukkan bahwa strain tidak dapat diidentifikasi
serotipenya.
DAFTAR
PUSTAKA
ISO
11290-2:1998. Microbiology of food and animal feeding stuff. Horizontal method
for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes. Geneva,
Switzerland.
HPA.
2011. UK standards for microbiology investigations: Identification of Listeria
species, and other non-sporing Gram positive rods (except Corynebacterium). HPA
Bacteriology identification ID 3 Issue No 2.1, October 2011. London, UK.
******
DETEKSI
TRICHINELLA SPP. DALAM SAMPEL PAKAN TERNAK
Prinsip
dan Ruang Lingkup
Trichinella
adalah genus parasit cacing nematoda yang dapat menyebabkan infeksi serius
(trichinellosis atau trichinosis) pada hewan, termasuk manusia, setelah
mengkonsumsi daging yang terinfeksi. Terdapat sepuluh genotipe dari Trichinella
yang sudah diketahui namun yang paling utama adalah Trichinella spiralis.
Spesies Trichinella ditemukan di seluruh dunia dan menginfeksi berbagai hewan,
sebagian besar karnivora dan omnivora pada mamalia liar, seperti rubah,
beruang, babi dan babi hutan. Tikus juga berperan penting sebagai host di
daerah endemik. Seluruh siklus hidup biasanya terdiri dari cacing dewasa dan
larva.
Babi
menjadi sumber infeksi utama pada manusia akibat mengkonsumsi daging babi
matang yang mengandung larva Trichinella. Infeksi babi terjadi akibat pakan
babi yang terkontaminasi dengan kotoran hewan.
Alat:
-Plastik
seal steril.
-Timbangan.
-Termometer.
-Stomacher
atau blender.
-Magnetic
stirrer (dengan kontrol thermostatic heating plate) dan stirring rod.
-3 L
beaker glass.
-Aluminium
foil.
-11
cm saringan (180 microns).
-Separation
funnel (lebih besar dari saringan) dengan keran dan dudukan.
-100
mL tabung ukur.
-Pipet.
-Cawan
petri plastik.
-Mikroskop
stereo.
Bahan:
-Distilled
water atau deionised water.
-25%
hydrochloride acid.
-Pepsin,
dengan perbandingan 1:12 500 BP (British Pharmacopoeia) sesuai dengan 1:10 000
NF (US National Formulary) dan 2 000 FIP (Fédération Internationale de
Pharmacie).
-90%
etil alkohol.
-Media
kontrol positif.
Prosedur
Manajemen
sampel
Pengujian
dilaksanakan ketika sampel datang. Apabila pengujian tidak dapat dilakukan pada
hari sampel dating, sampel harus disimpan pada suhu 2-8°C sampai dilakukan
pengujian. Sampel yang akan diperiksa, dikeluarkan dari kulkas dan disimpan
pada suhu kamar selama minimal satu jam sebelum dilakukan pengujian.
Pakan
ternak (100 g) dihomogenkan dalam blender atau stomacher dalam sedikit
distilled atau deionised water hangat. Jika pakan yang akan dihomogenkan
sedikit kera, maka dapat diblender sampai dengan 25 menit.
Pindahkan
sampel pakan homogen ke dalam 3 L beaker glass dan tambahkan air steril sampai
dengan 2 L dengan air steril yang telah dipanaskan sampai dengan 46-48°C.
Tambahkan 16 ± 0,5 mL 25% asam klorida (HCl) dan 10 ± 0,2 g pepsin.
Tambahkan
stirring rod dan tutup gelas dengan aluminium foil. Tempatkan beaker glass pada
stirrer untuk menghomogenkan sampel.
Sampel
dalam stirrer dipanaskan sampai partikel padat terlarut (sekitar 30 menit)
namun tidak boleh lebih dari 60 menit. Sampel homogeny dituangkan dan disaring
dengan saringan 180 mikron ke dalam corong pisah di atas gelas ukur dan
didiamkan selama kurang lebih 30 menit.
Pindahkan
40 ml cairan sampel ke dalam gelas ukur dan biarkan selama 10 menit.
Pindahkan
dengan hati-hati 30 mL supernatan dengan pipet dengan menyisakan tidak lebih
dari 10 mL dan tuangkan ke dalam cawan Petri plastik. Tambahkan 10 ml air
steril pada gelas ukur, bilas dan menambahkan ke cawan Petri yang sama.
Larva
Trichinella diperiksa di bawah mikroskop stereo pada pembesaran 15-20 x.
Naikkan perbesaran menjadi 60-100 x untuk memastikan bentuk parasit dan
mengkonfirmasi menggunakan atlas hewan, atlas medis atau atlas mikrobiologi.
Campuran sampel harus diperiksa sesegera mungkin. Larva dugaan dapat disimpan
dalam 90% etil alkohol untuk pengawetan dan dapat dilakukan konfirmasi di
laboratorium rujukan jika diperlukan.
DAFTAR
PUSTAKA
EN
SANCO/2537/2005. Laying down specific rules on official controls for
Trichinella in meat. August 2005 EU. Brussels, Belgium.
***
Catatatan:
Makalah
terjemahan ini telah diarsipkan di Perpustakaan Pusat Karantina Hewan dan
Keamanan Hayati Hewani dengan nomor katalog: 602.01.0025.PUSKH.II.2015. ditulis
oleh: drh. Dede Sri Wahyuni, MSi. Medik Veteriner Muda, Pejabat Fungsional
Pusat Karantina Hewan dan Keamanan Hayati Hewani, Badan Karantina Pertanian.
Tulisan
asli: Quality assurance for microbiology in feed analysis laboratories, by R.A.
Cowie. Edited by Harinder P.S. Makkar. FAO Animal Production and Health Manual
No. 16. Rome. FAO. 2013. “Isolation of Salmonella spp. from animal feed samples”:
page143, “Isolation of Listeria spp.
from animal feed samples”: 149. “Detection of Trichinella spp. in animal feed
samples”: page: 183.
******