TEKNIK PEMERIKSAAN LABORATORIUM TERHADAP PENYAKIT AFRICAN SWINE FEVER PADA BABI

Prosedur diagnostik laboratorium untuk African Swine Fever dibagi ke dalam dua kelompok: yang pertama berisi uji untuk isolasi virus, sedangkan yang kedua adalah uji untuk deteksi antibodi. Pemilihan uji yang akan dilakukan semestinya tergantung pada situasi penyakit dan kemampuan diagnosis laboratorium di daerah atau negara terdampak.

RINGKASAN
African swine fever (ASF) atau Demam babi afrika adalah penyakit menular pada babi ternakan dan babi liar dari semua bangsa (breed) babi dan semua usia, yang disebabkan oleh virus yang menimbulkan berbagai gejala gejala (sindrom). ASF akut ditandai dengan demam tinggi, perdarahan dalam sistem retikuloendotelial, dan dengan tingkat kematian yang tinggi. Kutu kecil dari genus Ornithodoros, terutama O. moubata dan O. erraticus, telah terbukti untuk menjadi reservoir dan vektor penularan virus ASF (ASFV).

ASFV adalah satu-satunya anggota keluarga Asfarviridae, genus Asfivirus.

Prosedur diagnostik laboratorium untuk ASF dibagi ke dalam dua kelompok: yang pertama berisi uji untuk isolasi virus dan deteksi antigen virus dan genomic DNA, sedangkan yang kedua berisi uji untuk deteksi antibodi. Pemilihan uji yang akan dilakukan tergantung pada situasi penyakit dan kemampuan diagnosis laboratorium di daerah atau negara.

Identifikasi agen penyakit: diagnosa laboratorium harus diarahkan ke isolasi virus dengan cara simultan melalui inokulasi leukosit babi atau kultur sumsum tulang, deteksi antigen dalam apusan atau bagian cryostat jaringan dengan fluorescent antibody test (FAT) dan deteksi DNA genom dengan polymerase chain reaction (PCR). PCR adalah teknik yang sangat baik, sangat sensitif, dan cepat untuk deteksi ASFV dan sangat berguna dalam berbagai situasi. Hal ini sangat berguna jika jaringan tidak cocok untuk isolasi virus dan deteksi antigen.

Dalam kasus yang meragukan, material yang di pasase dalam kultur sel leukosit dan prosedur yang dijelaskan di atas di ulang.

Uji serologis: Babi yang bertahan oleh infeksi alami biasanya mengembangkan antibodi terhadap ASFV dari 7-10 hari pasca-infeksi dan antibodi ini bertahan untuk jangka waktu yang lama. Di mana penyakit ini endemik, atau di mana wabah primer disebabkan oleh strain virulensi rendah, penyelidikan wabah baru harus mencakup deteksi antibodi spesifik dalam serum atau ekstrak dari jaringan yang diajukan. Berbagai metode seperti uji indirect fluorescent antibody (IFA), uji enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) dan uji imunoblotting yang tersedia untuk mendeteksi antibodi.

Persyaratan untuk vaksin: Saat ini, tidak ada vaksin untuk ASF.

PENDAHULUAN

Virus African swine fever (ASFV) adalah virus DNA beramplop ikosahedral besar kompleks yang menunjukkan banyak fitur (wajah) umum untuk kedua iridovirus dan familia poxvirus (Arias & Sánchez-Vizcaino, 2002a; Vinuela, 1985). Virus ini sekarang diklasifikasikan sebagai satu-satunya familia  yang disebut Asfarviridae (Dixon et al., 2005). Setidaknya 28 struktur protein telah diidentifikasi dalam partikel virus intraseluler (200 nm) (Sánchez-Vizcaino, 2006). Lebih dari seratus protein infeksius telah diidentifikasi dalam makrofag babi yang terinfeksi atau yang sembuh, dan setidaknya 50 dari mereka bereaksi dengan serum dari babi yang terinfeksi atau yang sembuh. Virus genom terdiri antara 170 dan 192 kilobases (kb), dengan kelestarian daerah tengah sekitar 125 kb dan akhir variabel. Daerah variable ini mengkodekan lima familia multigene yang terlibat langsung dengan variabilitas genom virus (Blasco et al., 1989). Analisis lengkap dari sequence beberapa strain ASFV telah dicapai (Chapman et al, 2008;.. De Villier et al, 2010). Strain yang berbeda dari ASFV bervariasi dalam kemampuan mereka untuk menyebabkan penyakit, tetapi saat ini hanya ada satu serotipe virus yang diakui terdeteksi dengan tes antibodi.

Epidemiologi molekuler penyakit ini diselidiki dengan sequencing di akhir terminal C dari gen-VP72, yang dibedakan hingga 22 genotipe yang berbeda (Boshoff et al, 2007;.. Lubisi et al, 2005). Sequencing genom penuh gen-P54 telah dikonfirmasi sebagai metode genotip tambahan yang berharga untuk studi epidemiologi molekuler (Gallardo et al., 2009). Peningkatan pemisahan adalah diperoleh dengan menganalisis variabel daerah pusat (Central Variable Region /CVR) dalam gen-B602L, digambarkan sebagai tempat paling variable untuk membedakan antara isolat terkait erat dan mengidentifikasi subgrup virus dalam beberapa dari 22 genotipe (Gallardo et al., 2009).

Virus ASF menghasilkan berbagai sindrom bervariasi dari perakut, akut penyakit kronis dan pembawa virus yang tampak sehat. Babi adalah satu-satunya spesies hewan domestik yang secara alami terinfeksi oleh ASFV. Celeng Eropa dan babi liar juga rentan terhadap penyakit, menunjukkan gejala klinis dan tingkat kematian serupa dengan yang diamati pada babi ternakan. Pada babi afrika liar seperti warthogs (Phacochoerus aethiopicus), babi hutan (Potamochoerus porcus) dan babi hutan raksasa (Hylochoerus meinertzhageni) tahan terhadap penyakit dan menunjukkan sedikit atau tidak ada gejala gejala klinis. Spesies ini dari babi liar berperan sebagai reservoir hospes dari ASFV di Afrika (Sánchez-Vizcaino, 2006).

Masa inkubasi di alam biasanya 4-19 hari. Strain virulesi ganas menghasilkan peracute atau penyakit hemoragik akut ditandai dengan demam tinggi, kehilangan nafsu makan, pendarahan di kulit dan organ, dan kematian pada 4-10 hari, kadang-kadang bahkan sebelum tanda-tanda klinis pertama yang diamati. Tingkat kematian mungkin mencapai 100%. Strain virulensi kurang ganas menghasilkan tanda-tanda klinis ringan - demam ringan, berkurangnya nafsu makan dan depresi - yang dapat membingungkan dengan banyak kondisi lain pada babi dan barangkali menyebabkan tidak curiga adanya ASF. Strain virulensi rendah, strain non-haemadsorbing sesekali menghasilkan infeksi non-hemoragik terutama subklinis dan serokonversi, tetapi beberapa hewan dapat mengembangkan lesi berbeda di paru-paru atau pada kulit di daerah atas tonjolan tulang dan daerah lainnya mengalami trauma. Hewan yang telah pulih dari infeksi baik akut atau kronis dapat menjadi terus-menerus terinfeksi, bertindak sebagai pembawa virus. Alasan /sebab biologis mengenai persistensi ASFV masih belum diketahui (Carrillo et al., 1994). Babi yang sembuh dan sebagai pembawa ASFV dan babi hutan terinfeksi secara persisten merupakan masalah terbesar dalam pengendalian penyakit ini. Pengenalan serologis babi carier adalah hal vital bagi keberhasilan program pemberantasan (Arias & Sánchez-Vizcaino, 2002b).

ASF tidak dapat dibedakan dari penyakit Classical Swine Fever (hog cholera, CSF) dengan pemeriksaan klinis atau bedah mayat, dan kedua penyakit harus dipertimbangkan dalam diagnosis banding dari setiap sindrom perdarahan demam akut (acute febrile haemorrhagic syndrome) pada babi. Bakteri septicaemia juga dapat membingungkan terhadap diagnosa ASF dan CSF. Tes laboratorium sangat penting untuk membedakan antara penyakit ini.

Di negara-negara yang terbebas dari ASF tapi mencurigai adanya penyakit ini, diagnosis laboratorium harus diarahkan isolasi virus dengan secara simultan melakukan inokulasi lekosit babi atau kultur sumsum tulang, deteksi antigen dalam apus atau bagian cryostat jaringan dengan Fluorescent Antibody Test (FAT) dan, dengan deteksi genom DNA dengan Polymerase Chain Reaction (PCR), yang merupakan teknik yang paling sensitif untuk mendeteksi keberadaan agen pada hewan terinfeksi persisten dan sangat berguna jika sampel yang dikirim tidak cocok untuk isolasi virus dan deteksi antigen karena sampel tersebut telah mengalami pembusukan. ASFV dapat dideteksi dengan PCR dari tahap yang sangat awal infeksi pada jaringan, darah-EDTA (ethylene diamine tetra-acetic acid) dan sampel serum. Babi yang sembuh dari infeksi akut atau kronis biasanya menunjukkan viremia selama beberapa minggu membuat tes PCR sebagai alat yang sangat berguna untuk mendeteksi DNA ASFV pada babi yang terinfeksi dengan strain virulensi rendah atau sedang.

Karena tidak ada vaksin yang tersedia, adanya antibodi ASFV merupakan indikasi infeksi sebelumnya dan, sebagai antibodi yang dihasilkan dari minggu pertama infeksi dan bertahan untuk waktu yang lama, mereka adalah penanda yang baik untuk diagnosis penyakit. Penampilan awal (dari 7 - 10 hari pasca-infeksi) dan persistensi subsequen jangka panjang dari antibodi membuat teknik deteksi antibodi, seperti ELISA, immunoblotting atau tes IFA, sangat berguna dalam mendiagnosis subakut dan bentuk kronis penyakit ini.

Epidemiologi ASF adalah komplek dengan pola epidemiologi yang berbeda dengan kejadian infeksi di Afrika dan Eropa. ASF terjadi melalui siklus transmisi yang melibatkan babi ternakan, babi hutan, babi liar afrika, dan kutu (Sánchez-Vizcaino et al., 2009). Di daerah dimana Ornithodorus kutu bertubuh lunak ada, deteksi ASFV di reservoir infeksi memberikan kontribusi untuk pemahaman yang lebih baik tentang epidemiologi penyakit. Ini adalah sangat penting dalam membangun kontrol dan program pemberantasan yang efektif (Basto et al., 2006).

ASF bukanlah penyakit zoonosis dan tidak mempengaruhi kesehatan masyarakat (Sánchez-Vizcaino et al., 2009).

ASFV harus ditangani di laboratorium yang telah disetujui oleh Otoritas yang kompeten mereka setelah OIE pedoman untuk biocontainment Grup 3 dan 4 patogen.

B. TEKNIK DIAGNOSTIK

1. Identifikasi agen

Ketika ASF disangkakan, sampel sampel berikut harus dikirim ke laboratorium: darah dalam antikoagulan (EDTA), limpa, kelenjar getah bening, tonsil dan ginjal. Ini harus disimpan sedingin mungkin, tanpa pembekuan, selama transit. Setelah sampel tiba di laboratorium, harus disimpan pada suhu - 70 ° C jika pemrosesan akan ditunda. Karena mempertahankan rantai dingin tidak selalu mungkin, sampel dapat disampaikan dalam glycerosaline; ini mungkin sedikit menurunkan kemungkinan isolasi virus, tetapi dapat memfasilitasi pengajuan sampel ke laboratorium sehingga wabah dapat dikonfirmasi.

Persiapan sampel untuk tes haemadsorpsi (haemadsorption)
i) Siapkan suspensi jaringan dengan menggiling 0,5 - 1,0 g potong dengan alu dan lesung (pestle and mortar) yang mengandung pasir steril, kemudian tambahkan 5 - 10 ml larutan garam buffer atau media kultur jaringan yang mengandung antibiotik.

ii) Jernihkan suspensi dengan sentrifugasi pada 1000 g selama 5 menit. Gunakan supernatan untuk kultur sel /haemadsorption (Bagian B.1.a bawah).

a) Uji Haemadsorpsi

Uji haemadsorption (HAD) (Malmquist & Hay, 1960) didasarkan pada kenyataan bahwa eritrosit babi akan melekat pada permukaan monosit babi atau makrofag sel yang terinfeksi ASFV dan bahwa sebagian besar virus isolat menghasilkan fenomena dari haemadsorption. Hasil positif dalam tes HAD adalah definitif untuk diagnosis ASF. Sebuah jumlah yang sangat kecil dari virus 'non-haemadsorbing' telah diisolasi, yang sebagian besar adalah virulen, tapi beberapa menghasilkan tipikal ASF akut. Pengujian dilakukan dengan inokulasi darah atau jaringan suspensi dari tersangka babi ke dalam kultur leukosit primer, (Prosedur 1 di bawah) atau ke alveolar kultur sel makrofag, dan juga dengan menyiapkan kultur leukosit dari darah babi diinokulasi di laboratorium atau dari darah dari babi terduga yang dikumpulkan di lapangan (Prosedur 2 bawah). Di atas 300 kultur dalam tabung dapat dibuat dari setiap 100 ml pengumpulan darah terdefibrinasi. Hal ini penting untuk melaksanakan semua prosedur sedemikian rupa untuk mencegah kontaminasi kultur.

Prosedur 1: Uji Haemadsorpsi dalam kultur leukosit primer
i) Kumpulkan volume yang diperlukan dari darah babi segar terdefibrinasi.

ii) Centrifuge pada 700 g selama 30 menit dan kumpulkan sel buffy coat. Tambahkan tiga volume 0,83% amonium klorida dengan leukosit yang diperoleh. Campur dan inkubasi pada suhu kamar selama 15 menit. Centrifuge pada 650 g selama 15 menit dan hati-hati buang supernatan. Cuci pelet di media atau buffer fosfat garam (PBS).

iii) Suspensi sel-sel pada konsentrasi 106-107 sel / ml dalam medium kultur jaringan yang mengandung 10 - 30% serum babi dan antibiotik. Untuk mencegah haemadsorption nonspesifik, media harus mengandung serum atau plasma dari babi yang sama dari mana leukosit diperoleh. Jika banyak sampel yang akan diuji, serum homolog dapat diganti dengan serum yang telah diidentifikasi dengan pra-screening sebagai mampu mencegah pembentukan auto-roset spesifik.

iv) Bagikan suspensi sel dalam 96 - well plate (sumur plate) dengan 200 µl per well (300.000 sel /well) dan inkubasikan pada suhu 37 ° C dengan kelembaban 5 % CO2 inkubator. Prosedur ini juga dapat dilakukan dalam aliquot dari 1,5 ml dalam 160 × 16 mm tabung dan inkubasikan dalam posisi miring (5-10 ° dari horisontal) pada 37 ° C.

Catatan: Untuk diagnosis rutin, hanya 2 - 4 hari umur kultur yang cukup sensitif.

v) Setelah 3 hari inokulasi tiga tabung atau well  plates  dengan menambahkan 0,2 ml /tabung atau 0,02 ml (1/10 pengenceran akhir) /well (sumur) sampel dipersiapkan. Dianjurkan untuk menginokulasi sepuluh kali lipat dan seratus kali lipat pengenceran ke dalam kultur, dan ini sangat penting ketika material lapangan diserahkan dalam kondisi yang buruk.

vi) Inokulasikan kultur yang positif dengan virus haemadsorbsi. Kontrol negatif diinokulasi  sangat penting untuk memantau kemungkinan haemadsorpsi nonspesifik.

vii) Tambahkan 0,2 ml preparasi segar 1% eritrosit babi dalam buffer salin ke masing-masing tabung. Dalam suatu kasus  96 well plate, tambahkan 0,02 ml 1% erytrocytes babi per sumur (well).

ix) Pembacaan hasil: Haemadsorpsi terdiri dari alat tambahan sejumlah besar eritrosit babi ke permukaan sel yang terinfeksi. Sebuah CPE terdiri dari pengurangan jumlah sel ikutan dalam ketiadaan haemadsorpsi mungkin karena sitotoksisitas pada inokulum, Virus penyakit Aujeszky atau non-haemadsorbing ASFV, yang dapat dideteksi oleh FAT pada sedimen sel atau dengan menggunakan PCR (lihat di bawah). Jika tidak ada perubahan yang diamati, atau jika hasil imunofluoresensi dan PCR tes negatif, subinoculasi supernatan sampai tiga kali dalam kultur leukosit segar. Semua isolasi harus dikonfirmasi dengan PCR dan sekuensing.

Prosedur 2: Uji 'autorosette' Haemadsorption dengan leukosit darah perifer dari babi yang terinfeksi

Prosedur ini lebih cepat dari pada preparasi dan inokulasi kultur primer leukosit babi (dijelaskan dalam Prosedur 1 di atas) dan akan memberikan hasil yang lebih cepat dalam kasus yang positif. Ini dapat dilakukan di laboratorium yang tidak dilengkapi untuk pemeriksaan virologi rutin; persyaratan minimum slide dan cover slip, mikroskop dan media steril, tabung atau botol dan pipet. Darah dari babi yang dicurigai di lapangan, atau mereka (material) diinokulasi di laboratorium, dikoleksi dalam heparin dan kultur leukosit dipersiapkan untuk pemeriksaan langsung untuk haemadsorpsi. Namun, hasil tes sulit untuk dievaluasi dan sekarang digantikan oleh PCR.

i) Kumpulkan 20 ml darah (whole blood) dalam syring yang mengandung 2000 IU heparin dalam 2 ml saline, campur dan pindah ke tabung gelas atau botol yang sempit.

ii) Tempatkan tabung /botol vertikal di dalam inkubator atau water bath pada 37° C, dan memungkinkan sel untuk memantapkan. Sedimentasi ditingkatkan dengan penambahan 2 ml volume ekspander plasma, seperti 'Dextravan150' yang merupakan solusi dari dekstran 150 di 0,9% NaCl untuk injeksi (Fisons, United Kingdom).

iii) Inkubasi kultur selama 6 - 8 jam pada 37° C, dan kemudian cek kultur dengan interval 2 - 3 jam dengan mentransfer aliquot kecil dari white-cell-rich supernatant, bersama-sama dengan beberapa eritrosit, pada slide kaca.

iv) Pembacaan hasil: Kehadiran haemadsorbing sel diidentifikasi di bawah mikroskop menunjukkan adanya ASFV. Haemadsorpsi terdiri dari ikutan sejumlah besar eritrosit babi ke permukaan sel yang terinfeksi. Banyak bukti bahwa haemadsorpsi akan menjadi cukup untuk mempertimbangkan pengulangan uji atau mengkonfirmasi kehadiran ASFV dengan tes lain seperti PCR.

b)   Deteksi Antigen dengan fluorescent antibody test (FAT)

FAT (Bool et al., 1969) dapat digunakan sebagai metode tambahan untuk mendeteksi antigen pada jaringan babi tersangka di lapangan atau yang diinokulasi di laboratorium. FAT positif ditambah tanda-tanda klinis dan lesi yang tepat dapat memberikan diagnosis dugaan ASF. Hal ini juga dapat digunakan untuk mendeteksi antigen ASFV dalam kultur leukosit yang ada tanpa HAD teramati dan dengan demikian dapat mengidentifikasi non-haemadsorbing strain virus. Hal ini juga membedakan antara CPE yang diproduksi oleh ASFV dan diproduksi oleh virus lain, seperti virus penyakit Aujeszky atau inokulum sitotoksik. Namun, penting untuk dicatat bahwa dalam penyakit subakut dan kronis, FAT memiliki signifikansi penurunan sensitivitas. Penurunan sensitivitas mungkin berhubungan dengan pembentukan antigen antibody komplek dalam jaringan babi yang terinfeksi yang menghalangi interaksi antara antigen ASFV dan konjugat ASF (Sánchez-Vizcaino, 2006).

Prosedur uji

i) Siapkan bagian cryostat atau pap smear pengujian jaringan, atau penyebaran sedimen sel dari kultur inokulasi leukosit pada slide, udara kering dan fiksasi dengan aseton selama 10 menit pada suhu kamar.

ii) Cat dengan fluorescein   isothiocyanate   (FITC)-conjugated   anti-ASFV   immunoglobulin pada pengenceran yang direkomendasikan atau pretitrasi selama 1 jam pada suhu 37° C dalam kelembaban ruangan.

iii) Fiksasi dan cat kontrol positif dan negatif dengan preparasi yang sama.

iv) Cuci dengan merendam empat kali dalam fresh PBS bersih, Pengecatan mount stain jaringan dalam PBS /gliserol, dan periksa di bawah mikroskop dengan cahaya ultraviolet dengan filter barier dan penguat (exciter) yang cocok.

v) Pembacaan hasil: Jaringan positif jika fluoresensi sitoplasma granular tertentu teramati dalam jaringan organ limfoid paracortical atau makrofag terfiksasi di organ lain, atau dalam kultur leukosit yang diinokulasi.

c) Deteksi virus genom dengan polymerase chain reaction (PCR)

Teknik PCR telah dikembangkan, menggunakan primer dari daerah yang sangat dilestarikan genomnya, untuk mendeteksi dan mengidentifikasi berbagai isolat milik semua genotipe virus yang dikenal, termasuk keduanya virus non haemadsorbing dan isolat virulensi rendah. Teknik-teknik PCR sangat berguna untuk mengidentifikasi virus DNA pada jaringan babi yang tidak cocok untuk isolasi virus atau deteksi antigen karena mereka telah mengalami pembusukan, atau ketika ada alasan yang baik untuk percaya bahwa virus mungkin telah dininaktifkan sebelum sampel diterima di laboratorium.

Dua prosedur PCR tervalidasi dijelaskan dan terdiri dari persiapan sampel diikuti dengan prosedur tes. Prosedur ini berfungsi sebagai pedoman umum dan titik awal untuk prosedur PCR. Kondisi optimal reaksi (waktu inkubasi dan suhu, model dan pemasok peralatan, konsentrasi reagen tes seperti primer dan dNTP) dapat bervariasi sehingga kondisi yang dijelaskan harus dievaluasi terlebih dahulu.

Prosedur Preparasi sampel (Agüero et al, 2003;. 2004)

Prosedur ekstraksi sensitif menggunakan komersial template preparasi tinggi PCR Kit 1 dijelaskan di bawah ini. Sejumlah kit ekstraksi DNA lainnya yang tersedia secara komersial untuk pembuatan template yang cocok untuk PCR tergantung pada sampel yang diajukan untuk analisis dan mungkin cocok untuk digunakan. Sampel yang berbeda dapat digunakan dalam prosedur ini seperti supernatan kultur sel, EDTA-darah, serum dan homogenasi jaringan, bahkan jika yang terakhir telah disimpan dalam kondisi hangat dan mengalami tingkat pembusukan. Prosedur ini memiliki keuntungan karena dapat digunakan untuk kedua ekstraksi DNA ASFV dan CSFV RNA yang memungkinkan deteksi simultan dari kedua virus pada multipleks PCR (Agüero et al., 2004).

Template preparasi murni tingi PCR Kit1 termasuk reagen berikut: Binding Buffer, Proteinase K, Inhibitor Removal Buffer, Wash Buffer, dan tabung High Pure Filter and tabung koleksi.

Untuk sampel organ dan jaringan, pertama siapkan 1/10 homogenat dari material dalam PBS, kemudian centrifuge untuk menjernihkan pada 12.000 g selama 5 menit. Ekstrak DNA /RNA dari cairan supernatan yang dihasilkan. Kadang-kadang dianjurkan untuk memproses 1/10 pengenceran supernatan secara paralel.

Ekstraksi untuk sampel kontrol: setidaknya satu control positif dan satu kontrol negatif harus disertakan dalam setiap melakukan ekstraksi asam nukletat. Sampel kontrol positif harus 200 µl serum positip ASFV, EDTA-darah, atau 1/10 homogenat jaringan (sejenis jaringan sebagai sampel yang akan dianalisis): kontrol negatif harus 200 µl air atau ASFV negatif EDTA- darah, atau homogenat jaringan. Kontrol seharusnya diproses dengan sampel uji.

Preparasi larutan kerja

Lyophilised proteinase K: larut proteinase K dalam 4,5 ml air suling steril, dan larutan aliquot dalam vial 500 µl. Simpan pada -20° C sampai digunakan.

Inhibitor Removal Buffer: tambahkan etanol 20 ml pada vial aslinya. Sesuai label dan tanggal botol.

Buffer pencuci: tambahkan etanol absolut 80 ml pada botol aslinya. Sesuai label dan tanggal botol.
i) Pipet 200 ml dari sampel ke dalam tabung 1,5 ml microcentrifuge.

ii) Tambahkan 200 µl buffer mengikat dan 40 µl proteinase K. campur segera. Inkubasikankan selama 10 menit pada 72 ° C.

iii) Secara singkat centrifuge 1,5 ml tabung microcentrifuge untuk meremove tetesan dari bagian dalam tutupnya.

iv) Tambahkan 100 ml isopropanol pada tabung sampel.

v) Tempatkan filter tabung murni (high pure) ke dalam tabung koleksi dan pipet sampelnya di dalam reservoir atas. Sentrifus selama 1 menit pada 8000 rpm. (Dengan sampel darah, ulangi langkah sentrifugasi jika sampel tetap dalam tabung filter.)

vi) Buang tabung pengumpulan dan tempatkan tabung filter ke dalam tabung koleksi bersih.

vii) Tambahkan 500 ml Inhibitor Removal Buffer ke reservoir atas dan sentrifus selama 1 menit pada 8000 rpm.

viii) Buang tabung pengumpulan dan menempatkan tabung filter ke dalam tabung koleksi bersih.

ix) Tambahkan 450 µl larutan buffer pencuci ke reservoir atas dan sentrifus selama 1 menit pada 8000 rpm.

x) Buang tabung koleksi dan ulangi langkah pencucian.

xi) Buang tabung koleksi dan tempatkan tabung filter ke dalam tabung koleksi bersih. Sentrifus selama 10 detik pada 13000 rpm untuk menghilangkan sisa penyangga mencuci.

xii) Buang tabung koleksi dan tempatkan tabung filter dalam 1,5 ml microcentrifuge tabung bersih.

xiii) Untuk elusi asam nukleat, tambahkan 50 µl penghangat (70 ° C) air steril ke reservoir atas (hati-hati untuk tidak menggunakan Buffer elusi termasuk dalam kit untuk CSFV RNA). Centrifuge selama 1 menit pada 8000 rpm.

xiv) Gunakan segera atau simpan pada -20° C untuk penggunaan waktu yang akan depan.

Amplifikasi PCR dengan PCR konvensional (Agüero et al., 2003)

Set primer ASFV primer menjelaskan dalam prosedur ini dapat dikombinasikan dengan satu set primer CSFV spesifik dalam multiplex metode RT-PCR yang memungkinkan deteksi perbedaan dan simultan dari kedua genom virus dalam reaksi tunggal (Agüero et al., 2004).

Larutan stok
Nuklease-bebas air steril.

Hot Star Taq Polimerase DNA, 10 × PCR Buffer II, dan magnesium klorida yang ada di pasaran.

PCR nukleotida campuran yang mengandung 10 mM disetiap dNTP tersedia di pasaran.

Marker DNA: 100 base-pair ladder is commercially available.

Primer pada konsentrasi 20 pmol /µl: Primer PPA-1 sequence 5'-AGT-TAT-GGG-AAA-CCC-GAC- CC-3 '(forward primer); primer PPA-2 sequence 5'-CCC-TGA-ATC-GGA-GCA-TCC-T-3 '(reverse primer).

10 × loading buffer: 0,2% xylene cyanol, 0,2% bromophenol biru, 30% gliserol.

TAE buffer (50 ×) untuk gel agarosa: Tris base (242 g); asam asetat glasial (57,1 ml); 0,5 M EDTA, pH 8,0 (100 ml); air suling (1 liter).

Marker DNA: 100 base-pair ladder tersedia di pasaran.

i) Dalam tabung microcentrifuge streril 1,5 ml persiapkan campuran reaksi PCR dijelaskan di bawah untuk masing-masing sampel. Siapkan campuran reaksi dalam jumlah besar untuk jumlah sampel yang akan diuji agar memungkinkan untuk setidaknya satu sampel tambahan.

ii) Nuclease-bebas atau air suling steril (17,375 µl 10 × PCR Buffer II (2,5 ml), magnesium klorida 25 mM (2 µl), dNTP mix 10mm (0,5 µl), primer PPA-1, 20 pmol /µl (0,25 µl), primer PPA-2, 20 pmol /µl (0,25 µl), Taq Gold DNA polymerase 5 U/µl (0.125 µl).

iii) Tambahkan 23 µl PCR reaction mix pada sejumlah yang diperlukan untuk 0,2 ml tabung PCR.

iv) Tambahkan 2μl dari template sampel ekstraksi pada masing-masing tabung PCR. Sertakan kontrol reaksi positip (2 µl ASFV DNA) dan kontrol reaksi negatif (2 ml air suling) pada masing-masing PCR run.

v) Tempatkan semua tabung dalam thermal cycler otomatis dan jalankan program berikut: Satu siklus pada 95° C selama 10 menit. 40 siklus pada 95° C selama 15 detik, 62° C selama 30 detik dan 72° C selama 30 detik. Satu siklus pada 72° C selama 7 menit. Tahan pada suhu 4° C.

vi) Pada akhir program, ambil tabung PCR dan tambahkan 2,5 ml dari 10 × buffer loading masing-masing tabung.

vii) Muat (load) semua sampel dalam gel agarosa 2% di buffer TAE yang mengandung etidium bromida pada konsentrasi akhir 0,5 µg /ml.

viii) Tambahkan DNA penanda (marker) ke salah satu jalur di setiap sisi gel.

ix) Jalankan (Run) gel pada tegangan konstan 150-200 volt selama sekitar 30 menit.

x) Pembacaan hasil: Periksa gel diatas sumber cahaya UV. Dalam sampel positif, band diskrit akan terlihat yang harus bekerja bermigrasi dengan produk PCR dari kontrol positif. Hitung ukuran produk PCR pada sampel uji dan kontrol positif dengan mengacu pada standar penanda. Produk PCR dari kontrol positif memiliki ukuran 257 pasangan basa. Tidak ada band terlihat dalam kontrol negatif.

xi) Opsional: Sebuah uji konfirmasi tambahan bisa dilakukan oleh BsmA I restriksi endonuklease pencernaan dari amplified produk. Untuk pengujian ini, inkubasikan selama 2,5 jam pada 55° C total 5 µl dari produk amplified DNA dalam volume akhir 20 ml campuran pencernaan: 2 ml 10 × buffer, 1 µl BsmA I (5 U /µl) dan 12 µl air suling steril. Kemudian, jalankan (run) sampel dalam gel agarosa 3% seperti dijelaskan di atas. Pola pembatasan harus mencakup dua fragmen dari 173-177 dan 84-80 pasangan basa dalam sampel positif.

Prosedur PCR: TaqMan® protokol PCR (King et al, 2003).

Persiapan sampel
Sejumlah kit ekstraksi DNA yang tersedia di pasaran untuk pembuatan template yang cocok untuk PCR tergantung pada sampel diajukan untuk analisis dan mungkin cocok untuk digunakan di Laboratorium Referensi.

The QIAamp® Viral RNA Mini Kit (QIAGEN) prosedur (protokol spin) dijelaskan di bawah ini. Kit ini dapat digunakan untuk darah dari hewan yang diduga swine fever. Darah dari babi yang terinfeksi harus diambil di EDTA. Deteksi ASFV dapat dilakukan secara paralel dengan virus CSF (lihat Bab 2.8.3 untuk CSFV metode deteksi molekuler).

i) Pipet 560 µl buffer yang disediakan AVL ke dalam tabung 1,5 ml microcentrifuge.

ii)   Tambahkan 140 µl tes atau kontrol sampel dan campur dengan vortex selama sekitar 15 detik. Sampel kontrol ASF negatif yang terdiri dari homogenat limpa dari babi tak terinfeksi dan sel sumsum tulang babi (Porcine bone marrow = PBM) tidak terinfeksi dan mononuklear darah perifer (Porcine blood mononuclrear = PBL) tidak terinfeksi harus diproses bersama sampel uji. Ekstraksi tambahan kontrol negatif juga dapat dipersiapkan untuk setiap sampel uji dan kontrol negatif terinfeksi dengan menjalankan (running) ekstraksi paralel dari air (nuclease-bebas) (semua kontrol di subsekuense dengan diuji dengan prosedur PCR bersama dengan sampel uji).

iii) Inkubasi pada suhu kamar setidaknya selama 10 menit.

iv) Secara singkat centrifuge tabung 1,5 ml microcentrifuge untuk menghilangkan tetes dari bagian dalam tutupnya.

v)  Tambahkan 560 µl etanol pada sampel, vortex selama kurang lebih 15 detik dan sebentar centrifuge untuk menghapus tetes dari bagian dalam tutupnya.

vi) Tambahkan 630 ml larutan dari v) ke kolom spin QIAamp (dalam tabung koleksi 2-ml) tanpa membasahi RIM. Tutup capnya dan centrifuge selama 1 menit pada 6000 g. Tempatkan kolom spin ke dalam 2 ml koleksi tabung bersih dan buang tabung yang berisi filtrat.

vii) Hati-hati membuka kolom spin QIAamp dan ulangi langkah vi.

viii) Hati-hati membuka kolom berputar QIAamp dan tambahkan 500 µl Buffer AW1. Tutup penutupnya dan centrifuge selama 1 menit pada 6000 g. Tempatkan kolom spin ke dalam 2 ml tabung koleksi bersih dan membuang tabung yang berisi filtrat.

ix) Hati-hati membuka kolom spin QIAamp dan tambahkan 500 ml Buffer AW2. Tutup penutupnya dan centrifuge selama 3 menit pada 20.000 g.

x) Tempatkan kolom spin QIAamp dalam tabung 1,5 ml microcentrifuge baru. Buang tabung koleksi lama yang mengandung filtrat. Hati-hati membuka kolom spin QIAamp dan tambahkan 60 ml Buffer AVE. Tutup penutupnya dan inkubasi pada suhu kamar selama 1 menit. Centrifus selama 1 menit pada 6000 g.

xi) Buang kolom spin QIAamp berputar. Simpan ekstrksian DNA (60 ml) pada -20° C sampai diperlukan untuk prosedur amplifikasi PCR.

Larutan stok

i) Nuclease bebas atau air steril lain yang sesuai dan TaqMan® PCR campuran master reaksi (2 ×).
ii) Primer pada konsentrasi 50 pmol /µl: Primer 1 seqquence 5'-CTGCT-CATGG-TATCA-ATCTT-ATCGA-3 '(stran positif); Primer 2 urutan 5'-GATAC-CACAA-GATC (AG)-GCCGT-3 '(strand negatif).

iii)  TaqMan® probe  pada konsentrasi 5 pmol /µl: (5 '- [6-karboksi-fluorescein (FAM)]-CCACG-GGAGG-AATAC-CAACC-CAGTG-3' - [6-karboksi-tetrametil-rhodamine (TAMRA)]).

Amplifikasi PCR dengan TaqMan® assay (Fernández-Pinero et al., 2010)

i) Dalam tabung steril 1,5 ml microcentrifuge persiapkan campuran reaksi PCR dijelaskan di bawah untuk masing-masing sampel. Siapkan campuran reaksi dalam jumlah besar untuk jumlah sampel yang akan diuji, tetapi memungkinkan untuk satu sampel tambahan.
Nuklease bebas atau air steril (7,5 µl); (2 × conc.) TaqMan® PCR reaksi master mix (12,5 ml); primer 1, 50 pmol (1,0 µl); primer 2, 50 pmol (1,0 µl); TaqMan® probe, 5 pmol (1 µl).

ii) Tambahkan 22 µl campuran reaksi PCR pada well plate reaksi optik MicroAmp® untuk setiap sampel yang akan diuji.

iii) Tambahkan 3 µl pada Template sampel ekstraksi atau kontrol ekstraksi kosong dan amankan dengan menutupi setiap wellnya (sumurnya).

iv) Putar piring selama 1 menit dalam centrifuge yang cocok untuk mencampur isi dari setiap wellnya.

v) Tempatkan piring di TaqMan® sequence Detection System untuk amplifikasi PCR dan jalankan (run) program berikut:

Satu siklus pada 50° C selama 2 menit, Satu siklus pada 95° C selama 10 menit, Empat puluh siklus pada 95° C selama 15 detik, 58° C selama 1 menit.

Catatan: Jika TaqMan® termal cycler tidak tersedia, thermal cycler biasa dapat digunakan dan produk PCR dianalisa dengan pembacaan fluoresensi titik akhir atau dengan alternatif memakai elektroforesis pada gel agarosa 1,5%. Sebuah produk dari 250 bp yang diharapkan.

vi) Pembacaan hasil: Menetapkan siklus ambang batas (CT) nilai setiap reaksi PCR dari scan semua plot amplifikasi (plot sinyal fluoresensi dibandingkan jumlah siklus). Sampel tes negatif, tidak terinfeksi negatif atau control kosong ekstraksi harus memiliki nilai CT> 40,0. Sampel uji yang positif dan kontrol harus memiliki nilai CT <40,0 (sampel sangat positif memiliki nilai CT <30,0).

Modifikasi protokol ini menggunakan berbagai kit amplifikasi komersial dapat memberikan hasil PCR yang lebih tinggi, namun kit amplifikasi ini harus sepenuhnya divalidasi sebelum digunakan.

2. Tes serologis

Antibodi bertahan pada babi yang sembuh untuk waktu yang lama setelah infeksi, kadang-kadang untuk hidup, dan sejumlah tes sudah ada untuk mendeteksi antibodi ini, meskipun hanya beberapa dari mereka telah dikembangkan untuk penggunaan rutin di laboratorium diagnostik (Escribano et al., 1990; Pastor et al, 1990;. Sánchez-Vizcaino, 1987). Yang paling umum digunakan adalah ELISA (Sánchez-Vizcaino et al, 1983;. Wardley et al, 1979.), Yang cocok untuk memeriksa baik serum atau cairan dari jaringan. Pengujian konfirmasi sampel ELISA positif harus dilakukan dalam kasus-kasus penting menggunakan tes alternatif, seperti tes IFA, pewarnaan immunoperoxidase atau imunoblotting (Escribano et al, 1990;. Pastor et al, 1989.). Antibodi biasanya tidak terdeteksi pada babi yang terinfeksi ASFV yang virulen karena mereka mati sebelum diproduksi. Antibodi diproduksi pada babi yang terinfeksi virus ASF yang virulensinya rendah atau cukup mematikan, tetapi ini bukan sepenuhnya antibody netralisasi.

Baru-baru ini, sebuah studi ekstensif yang dilakukan untuk menilai kekhususan dan sensitivitas tes serologi ASF dalam skenario epidemiologi yang berbeda Afrika dan Eropa, dengan saat ini beredar isolat ASFV (termasuk genotipe Kaukasia II dan isolat Afrika Timur menunjukkan variabilitas lebih), telah menunjukkan bahwa tes yang ditentukan OIE dapat mendeteksi dengan akurasi dan sensitivitas tinggi adanya antibodi ASF di semua situasi epidemiologi yang dievaluasi (Gallardo et al., 2010).

Ketika ASF endemik, konfirmasi kasus dugaan penyakit yang terbaik adalah dilakukan dengan menggunakan tes standar serologi (ELISA), dikombinasikan dengan tes serologi alternatif (IFA) atau tes antigen-deteksi. Di beberapa negara, lebih dari 95% dari kasus positif telah diidentifikasi menggunakan kombinasi tes IFA dan FAT (Sánchez-Vizcaino, 2006).

Perlu dicatat bahwa ketika babi telah terinfeksi isolat avirulen atau dari virulensi rendah, tes serologi mungkin satu-satunya cara untuk mendeteksi hewan yang terinfeksi.

a) Enzim-Linked Immunosorbent Assay (tes ditetapkan untuk perdagangan internasional)

ELISA (Pastor et al., 1990) adalah tes langsung yang dapat mendeteksi antibodi terhadap ASFV pada babi yang telah terinfeksi oleh virus yang virulensinya rendah atau sedang. Sebuah kit ELISA komersial yang sangat sensitif dan spesifik berdasarkan format kompetisi yang telah divalidasi untuk digunakan dalam situasi epidemiologi yang berbeda sudah tersedia dipasaran. Sebuah alternatif yang lebih murah adalah dengan menyiapkan larutan antigen untuk digunakan pada indirect ELISA, dan prosedur penggunaan larutan antigen ini dijelaskan di bawah ini.

ELISA menunjukkan sensitivitas menurun ketika sampel serum yang akan diuji diawetkan secara jelek. Untuk mengatasi masalah ini, beberapa ELISA-base baru dalam penggunaan ASFV protein rekombinan baru sekarang sedang divalidasi (Gallardo et al., 2006).

Melaksanakan tes konfirmasi kedua seperti tes imunoblotting, tes IFA atau tes immunoperoxidase dijelaskan di bawah dianjurkan dalam kasus dengan hasil yang diragukan atau hasil positif ketika sera yang diduga dengan pengawetan yang jelek.

Persiapan Antigen untuk ELISA
Antigen ELISA disiapkan dari pertumbuhan sel terinfeksi dari serum babi (Escribano et al., 1989).

i) Sel MS (monkey stable) terinfeksi pada banyaknya infeksi 10 virus teradaptasi, dan diinkubasi pada media yang mengandung 2% serum babi.

ii) Panen sel-sel pada 36-48 jam pasca-infeksi, ketika CPE meluas. Cuci di PBS, sedimen pada 650 g selama 5 menit, cuci pelet sel dalam 0,34 M sukrosa pada 5 mM Tris / HCl, pH 8,0, dan centrifuge pada pelet sel.

Lakukan langkah-langkah (iii) ke (v) di atas es:

iii) Resuspesi pelet sel dalam 67 mM sukrosa pada 5 mM Tris / HCl, pH 8,0 (1,8 ml per 175 cm2 flask), dan biarkan selama 10 menit dengan menggoncangka setelah 5 menit.

iv) Tambahkan nonionik Nonidet deterjen P-40 ke konsentrasi akhir 1% (w / v), dan biarkan selama 10 menit (dengan menggoncangka setelah 5 menit) untuk melisiskan sel.
v) Tambahkan sukrosa sampai konsentrasi akhir 64% (b / b) dalam 0,4 M Tris /HCl, pH 8,0, dan centrifuge pada 1000 g selama 10 menit untuk inti pelet.

vi) Kumpulkan supernatan dan menambahkan EDTA (konsentrasi akhir 2 mM), beta-mercaptoethanol (konsentrasi akhir 50 mM) dan NaCl (0,5 M konsentrasi akhir) di 0,25 mM Tris /HCl, pH 8,0, dan inkubasikan selama 15 menit pada 25° C.

vii) Sentrifus 100.000 g selama 1 jam pada suhu 4° C di atas layer 20% (b / b) sukrosa dalam 50 mMTris / HCl, pH 8,0. Hapus band tepat di atas lapisan sukrosa dan digunakan sebagai antigen ELISA. Simpan pada -20 ° C.

Prosedur Indirect ELISA (Pastor et al., 1990)
i) Coat ELISA polysorp piring microtiter (s) dengan antigen dengan menambahkan 100 ml dari yang direkomendasikan atau pretitrasi pengenceran antigen dalam 0,05 M karbonat /buffer bikarbonat, pH 9,6, masing-masing well (sumur).

ii) Inkubasikan pada suhu 4 ° C selama 16 jam (semalam) dan kemudian cuci lima kali dengan 0,05% Tween 20 di PBS, pH 7,2.

iii) Encerkan serum tes dan serum kontrol positif dan negatif 1/30 pada 0,05% Tween 20 dalam PBS, pH 7,2, dan tambahkan 100 ml masing-masing serum diencerkan untuk menduplikasi well (sumur) plate coated antigen (s).

Jika empat pasang setiap kontrol serum positif dan negatif ditambahkan ke well di berbagai bagian plate, 40 sera dapat diuji dalam duplikat pada satu piring, seperti yang ditunjukkan pada rencana pelat bawah:
 
+    









-











-



+




-






+




-






-




+






-




+



-










+
-










+

iv) Inkubasikan plate pada 37 ° C selama 1 jam (opsional pada shaker plate), dan kemudian cuci lima kali dengan 0,05% Tween 20 di PBS.

v) Untuk masing-masing well tambahkan 100 ml protein-A /konjugat horseradish peroxidase (Pierce) pada larutan pretitrasi yang direkomendasikan pada 0,05% Tween 20 dalam PBS.

vi) Inkubasikan plate pada 37 ° C selama 1 jam, kemudian cuci lima kali dengan 0,05% Tween 20 dalam PBS.

vii) Substrat: Tambahkan hidrogen peroksida untuk larutan substrat (0,04% orthophenylenediamine (OPD) dalam fosfat /buffer sitrat, pH 5.0) sebesar 10 µl/ 25 ml, dan tambahkan 100 ml substrat pada masing-masing well (sumur).
Atau, DMAB / MBTH larutan substrat dapat digunakan sebagai pengganti OPD: Tambahkan 200 µl substrat pada setiap well (10 ml larutan DMAB 80,6 mM + 10 ml larutan MBTH1.56mM + 5 ml H2O2).

DMAB /MBTH substrat preparasi:

DMAB - 3-Dimethylaminobenzoic acid (SIGMAD-07871643); MBTH - 3-Methyl-2-benzothiazolinone hidrazon hidroklorida monohidrate (SIGMA M-8006).

Larutan DAMB 80,6 mM: Larutkan 13,315 g asam DAMB 1000 ml dalam 0,1 M buffer fosfat, pH 7 (5,3 g KH2PO4, 8.65 g Na2HPO4 dibuat sampai 1000 ml dalam air suling) dengan goncangan kontinyu selama 1 jam pada suhu kamar, sesuaikan pH 7 dengan NaOH (5 M). Saring melalui corong.

Larutan MBTH 1,56 mM: Larutkan 0,3646 g MBTH 1000 ml 0,1 M buffer fosfat, pH 7 (5,3 g KH2PO4, 8,65 g Na2HPO4 dibuat sampai 1000 ml dalam air suling) dengan goyangan kontinyu selama 1 jam, sesuaikan pH 6,25 untuk dengan asam klorida pekat. Saring melalui corong.

Volume yang dibutuhkan per plate adalah: 10 ml DMAB + 10 ml + 5 ml MBTH H2O2 30% Substrat dapat disiapkan sebagai larutan stok, aliquoted dan disimpan pada -20 ° C. Campur DAMB dan arutan MBTH (1/1) sebelum digunakan dan tambahkan jumlah yang diperlukan dari 30% H2O2.

viii) Inkubasikan pada suhu kamar selama kurang lebih 6-10 menit (sebelum kontrol negatif mulai berwarna). Waktu yang diperlukan warna untuk mengembangkan akan tergantung pada kedua suhu substrat ketika ditambahkan ke well plate, dan suhu kamar.

ix) Hentikan reaksi dengan menambahkan 100 µl asam sulfat 3 N pada masing-masing well.

x) Pembacaan hasil: sera positif memiliki warna yang jelas (kuning dalam kasus OPD substrat, biru dalam kasus DMAB / MBTH substrat) dan dapat dibaca oleh mata, tetapi untuk memastikan bahwa semua sera positif diidentifikasi, maka perlu membaca absorbansi pada setiap well spektrofotometri, pada 492 nm (OPD substrat) atau 600-620 nm (dalam kasus DMAB / MBTH), dalam sebuah pembaca ELISA. Menggunakan substrat OPD serum setiap dianggap positif jika memiliki nilai absorbansi lebih dari dua kali nilai absorbansi rata-rata dari serum kontrol negatif di piring itu. Menggunakan DMAB / MBTH substrat, tes divalidasi ketika nilai absorbansi rata-rata dari kontrol positif lebih dari empat kali rata-rata absorbansi kontrol negatif.

Untuk benar menginterpretasikan hasil perlu untuk menghitung titik cut-off yang memungkinkan diferensiasi hasil negatif, tidak meyakinkan dan positif. Cut-off point didapat oleh persamaan berikut:

Cut-off = density Optik density serum negatif × 1 + densitas optik serum positif × 0,2.

- Sera dengan densiti optik bawah cut-off - 0,1 dapat dianggap negatif.
- Sera dengan densiti optik lebih tinggi dari cut-off + 0.1 dapat dianggap positif.
- Sera dengan densiti optik antara cut-off ± 0,1 dapat dianggap tidak meyakinkan dan hasilnya perlu dikonfirmasi oleh teknik IB.

b) Uji antibodi indirek fluorescent
Tes ini (Pan et al., 1974) seharusnya digunakan sebagai tes konfirmasi untuk sera dari daerah yang bebas dari ASF dan positif dalam ELISA, dan sera dari daerah endemis yang memberikan hasil yang tidak meyakinkan dalam ELISA.

Prosedur uji
i) Siapkan suspensi sel ginjal babi atau monyet trinfeksi ASFV pada konsentrasi 5 × 105 sel /ml, spray tetes kecil pada slide kaca, kering udara dan fiksasi dengan aseton pada suhu kamar selama 10 menit. Perhatikan bahwa slide dapat disimpan pada -20 ° C sampai siap untuk digunakan.

ii) Panaskan sera tes yang negatif pada 56 ° C selama 30 menit.

iii) Tambahkan pengenceran yang tepat dari sera tes dan sera kontrol positif dan negatif dalam buffer salin ke slide kedua sel kontrol yang terinfeksi dan tidak terinfeksi, dan inkubasi selama 1 jam pada suhu 37 ° C dalam ruang yang lembab.

iv) Cuci slide dengan cara merendam empat kali dalam PBS segar segar dan kemudian dengan air suling.

v) Tambah dengan pengenceran yang telah ditentukan atau direkomendasikan konjugat anti-babi imunoglobulin /FITC atau konjugat protein-A /FITC ke semua slide, dan inkubasikan selama 1 jam pada suhu 37° C dalam ruangan lembab.

vi) Cuci slide dengan cara merendam empat kali dalam PBS bersih segar dan kemudian dengan air suling, dalam PBS /gliserol, dan periksa di bawah mikroskop cahaya ultraviolet dengan barrier yang sesuai dan filter exciter.

vii) Pembaca hasil: Kontrol serum positif pada sel yang terinfeksi harus positif dan semua kontrol lainnya harus negatif sebelum tes dapat dibaca. Sera yang positif jika kultur terinfeksi menunjukkan fluoresensi spesifik.

c) Uji Immunoblotting (Escribano et al, 1990;.. Pastor et al, 1989)
Tes ini harus digunakan sebagai alternatif untuk tes IFA untuk mengkonfirmasi hasil samar-samar dengan sera individu. Tes imunoblotting sangat spesifik dan memungkinkan interpretasi dengan mudah dan lebih objektif dari hasil dan pengakuan yang lebih baik dari sampel positif-lemah.

Protein virus yang menimbulkan antibodi spesifik pada babi telah ditentukan. Polipeptida ini telah ditempatkan pada strip antigen dan telah ditunjukkan dalam tes imunoblotting untuk bereaksi dengan antibodi dari 9 hari pasca-infeksi.

Persiapan strip antigen
i) Siapkan cytoplasmic soluble virus proteins sesuai yang dijelaskan untuk persiapan antigen ELISA dalam Bagian B.2.a.

ii) Electrophorese sampai 17% akril-amida / N, N'-diallyltartardiamide (DATD) gel dengan standar berat molekul yang sesuai.

iii) Transfer protein ke membran nitroselulosa 14 × 14 cm2 dengan elektroforesis pada arus konstan dari 5 mA /cm dalam buffer transfer (20% metanol dalam 196 mM glisin, 25 mMTris / HCl, pH 8.3).

iv) Keringkan membran dan label sisi di mana protein dielektroforesis.

v) Potong satu strip dari tepi filter dan laksanakan prosedur imunoblotting sesuai dijelaskan di bawah. Identifikasi daerah yang mengandung protein 23-35 kDa dibandingkan dengan standar berat molekul dijalankan (run) secara paralel, dan potong daerah ini menjadi 0,5 cm strip lebar. Label setiap strip di sisi di mana protein dielektroforesis.

Strip ini (sekitar 4 cm panjangnya) merupakan strip antigen yang digunakan untuk imunoblotting dan mengandung protein dengan antibody yang mana di kedua sera akut dan babi sembuh akan bereaksi. Antibodi ini persisten (bertahan) hidup di beberapa babi.

Persiapan larutan substrat chloranaphthol.
Larutan ini harus disiapkan segera sebelum digunakan.

i) Larutkan 6 mg 4-chloro-1-naftol dalam 2 ml metanol dan tambahkan larutan ini perlahan-lahan sampai 10 ml PBS sambil diaduk.

ii) Lepaskan endapan putih yang terbentuk dengan penyaringan melalui Whatman No.1 kertas saringan (opsional).

iii) Tambahkan 4 µl  30% hidrogen peroksida.

Prosedur uji
Strip antigen harus dijaga dengan melabel sisi paling atas selama prosedur immunoreaction.

i) Inkubasi strip antigen dalam buffer blocking (susu kering 2% non-lemak dalam PBS) pada suhu 37 ° C selama 30 menit dengan goyangan kontinyu kontinyu.

ii) Siapkan 1/40 pengenceran tes sera dan sera control positif dan negatif dalam buffer blocking.

iii) Inkubasikan strip antigen dalam serum yang tepat pada 37° C selama 45 menit dengan penggoyangan (agitasi) kontinyu. Inkubasikan satu strip antigen dalam serum control positip dan satu di serum kontrol negatif. Kedua strip adalah kontrol. Cuci empat kali dalam buffer blocking; pencucian akhir sebaiknya selama 5 menit dengan goyangan (agitasi) kontinyu.

iv) Tambahkan protein-A /konjugat horseradish peroxidase di pengenceran yang direkomendasikan atau pretitrasi (biasanya pada 1/1000 pengenceran) dalam buffer blocking untuk semua strip antigen. Inkubasikan pada suhu 37° C selama 45 menit dengan goyangan (agitasi) kontinyu. Cuci empat kali dalam buffer blocking; pencucian akhir harus selama 5 menit dengan digoyang kontinyu.

v) Siapkan larutan substrat, tambahan strip antigen, dan inkubasikan pada suhu kamar selama 5 - 15 menit dengan digoyang (agitasi) kontinyu.

vi) Hentikan reaksi dengan air suling ketika protein band gelap.

vii) Pembacaan hasil: Reaksi sera positip dengan lebih dari satu protein virus di strip antigen; mereka harus memberikan pola protein yang sama dan memiliki intensitas warna yang sama sebagai stain strip antigen dengan control serum positif serum.

C. PERSYARATAN VAKSIN

Saat ini tidak ada vaksin untuk ASF (Afrcan Swine Fever).


DAFTAR PUSTAKA

AGÜERO M., FERNÁNDEZ J., ROMERO L., SANCHEZ C., ARIAS M. & SÁNCHEZ-VIZCNO J.M. (2003). Highly sensitive PCR assay for the routine diagnosis of African swine fever virus in clinical samples, J .Clin. Microbiol., 41 (9),44314434.

AGÜERO M., FERNÁNDEZ J., ROMERO L., ZAMORA M.J., SANCHEZ C., BELÁK S., ARIAS M. & SÁNCHEZ-VIZCNO J.M. (2004). A highly sensitive and specific gel-based multiplex RT-PCR assay for the simultaneous and differential diagnosis of African swine fever and Classical swine fever. Vet. Res., 35, 1–13.

ARIAS M. & NCHEZ-VIZCNO J.M. (2002a). African swine fever. In: Trends in Emerging Viral Infections of Swine, Iowa State University press, pp 119124. ISBN 0813803837.

ARIAS M. & SÁNCHEZ-VIZCNO J.M. (2002b). African swine fever eradication: the Spanish model. In: Trends in Emerging Viral Infections of Swine, Iowa State University Press, pp 133–139. ISBN 0813803837.

BASTO  A.P., PORTUGAL  R.S., NIX  R.J., CARTAXEIRO  C., BOINAS  F., DIXON  L.K., LEITAO  A. & MARTINS C. (2006). Development of a nested PCR and its internal control for the detection of African swine fever virus (ASFV) in Ornithodoros erraticus. Arch. Virol., 151 (4), 819826.

BLASCO R., AERO M., ALMENDRAL J.M. & VIÑUELA E. (1989). Variable and constant region in African swine fever virus DNA. Virology, 168, 330–338.

BOOL P.H., ORDAS A. & SANCHEZ BOTIJA C. (1969). El diagnostico de la peste porcina africana por inmunofluorescencia. (The diagnosis of African swine fever by immunofluorescence). Bull. OIE, 72, 819839.

BOSHOFF  C.I., BASTOS  A.D., GERBER  L.J. &VOSLOO  W. (2007).Genetic characterisation of African swine fever viruses from outbreaks in southern Africa (19731999).Vet.Microbiol.,121 (1–2), 4555.

CARRILLO C., BORCA M.V., AFONSO C.L., ONISK D.V. & ROCK D.L. (1994). Long-term persistent infection of swine monocytes/macrophages with African swine fever virus.J. Virol., 68, 580583.

CHAPMAN D.A., TCHEREPANOV V., UPTON C. & DIXON L.K (2008).Comparison of the genome sequences of non- pathogenic and pathogenic African swine fever virus isolates. J.Gen. Virol., 89, 397408.

DEVILLIER E.P., GALLARDO C., ARIAS M.,DA SILVA M.,UPTON C., MARTIN R. & BISHOP R.P. (2010). Phylogenomic analysis of 11 complete African swine fever virus genome sequences.Virol., 400 (1), 128136.

DIXON L.K., ESCRIBANO J.M., MARTINS C., ROCK D.L., SALAS M.L. & WILKINSON P.J. (2005). In: Virus Taxonomy, VIIIth Report of the ICTV, Fauquet C.M., Mayo M.A., Maniloff J, Desselberger U.& Ball L.A., eds. Elsevier/Academic Press, London, UK. 135–143.

ESCRIBANO J.M., PASTOR M.J., ARIAS M. & SANCHEZ VIZCAINO J.M. (1990). Confirmación de sueros positivos a ELISA-peste porcina africana, mediante la técnica de ‘Immunoblotting’. Utilización de las proteínas inducidas por el virus con pesos moleculares comprendidos entre 23 y 35 kilodaltons, en el desarrollo de un ‘kit’ de diagnóstico. (Confirmation of sera positive by ASF ELISA with the immunoblotting technique. Use of virus-induced proteins of 2325 kDa in the development of a diagnostic kit.) Med. Vet., 7, 135–141.

ESCRIBANO J.M., PASTOR M.J. & SANCHEZ VIZCAINO J.M. (1989). Antibodies to bovine serum albumin in swine sera: implications for false positive reactions in the sero diagnosis of African swine fever. Am. J. Vet. Res.,50, 1118–1122.

FERNÁNDEZ-PINERO J., GALLARDO C., ELIZALDE M., RASMUSSEN T.B., STAHL K., LOEFFEN W., BLOME S., BATTEN C., CROOKE H., LE POTIER M.F.,UTTENTHAL Å., LEBLANC N., ALBINA E., KOWALCZYK A., MARKOWSKA-DANIEL I., TIGNON M., DE MIA G.M., GIAMMARIOLI M., ARIAS M. & HOFFMANN B. (2010). EPIZONE ring trial on ASFV real-time PCR. Annual Meeting of National African Swine Fever Laboratories, 18 May 2010, Pulawy, Poland.

GALLARDO C., BLANCO E., RODRÍGUEZ M.J., CARRASCOSA A. & SANCHEZ-VIZCAINO J.M. (2006). Antigenic properties and diagnostic potential of African swine fever virus protein pp62 expressed in insect cells. J. Clin. Microbiol., 44 (3), 14891495.

GALLARDO C., MWAENGO D.M., MACHARIA J.M., ARIAS M., TARACHA E.A., SOLER A., OKOTH E., MARTÍN E., KASITI J.& BISHOP RP.(2009). Enhanced discrimination of African swine fever virus isolates through nucleotide sequencing of the p54, p72, and pB602L (CVR) genes. Virus Genes, 38 (1), 85–95.

GALLARDO C., SOLER A., SIMÓN A., MARTÍN E., MARTÍN R., PELAYO V.,OKOTH E.,BISHOP R., SÁNCHEZ M.A., DE MIA G.,FASINA F.O., SÁNCHEZ-VIZCAÍNO, J.M. & ARIAS M.(2010). African Swine Fever Threat: Evaluating diagnostic tools with ASFV circulating strains. Annual Meeting of National African Swine Fever Laboratories, 18 May 2010, Pulawy, Poland.

KING D.P., REID S.M., HUTCHINGS G.H., GRIERSON S.S., WILKINSON P.J., DIXON L.K., BASTOS A.D.S. & DREW T.W. (2003). Development of a TaqMan® PCR assay with internal amplification control for the detection of African swine fever virus. J. Virol. Methods, 107, 53–61.

LUBISI B.A., BASTOS A.D., DWARKA R.M. & VOSLOO W.(2005).Molecular epidemiology of African swine fever in East Africa. Arch Virol., 150 (12), 24392452.

MALMQUIST W.A. & HAY D. (1960). Haemadsorption and cytopathic effect produced by African swine fever virus in swine bone marrow and buffy coat cultures. Am. J. Vet. Res., 21, 104–108.

PAN I.C., TRAUTMAN R., HESS W.R., DE BOER C.J., TESSLER J., ORDAS A., SANCHEZ BOTIJA C., OVEJERO J. & SANCHEZ M.C. (1974). African swine fever: comparison of four sero tests on porcine serums in Spain. Am. J. Vet. Res., 35,78790

PASTOR  M.J., ARIAS  M. & ESCRIBANO  J.M. (1990). Comparison of two antigens for use in an enzyme-linked immunosorbent assay to detect African swine fever antibody. Am. J. Vet. Res.,51, 15401543.

PASTOR M.J., LAVIADA M.D., SANCHEZ VIZCAINO J.M. & ESCRIBANO J.M. (1989). Detection of African swine fever virus antibodies by immunoblotting assay. Can. J. Vet. Res., 53, 105107.

SÁNCHEZ-VIZCNO J.M. (1987). African swine fever diagnosis. In: African Swine Fever, Becker Y., ed. Martinus Nijhoff, Boston, USA, 63–71.

SÁNCHEZ-VIZCNO J.M. (2006). African swine fever. In: Diseases of Swine,Ninth Edition,Straw B.,D’Allaire S., Mengeling W., Taylor D., eds. Iowa State University,USA, pp. 291298.

SÁNCHEZ-VIZCNO J.M., CROWTHER J.R. & WARDLEY R.C. (1983). A collaborative study on the use of the ELISA in the diagnosis of African swine fever. In: African Swine Fever. (CEC/FAO Research Seminar, Sardinia, Sept.

1981). Wilkinson P.J., ed. Commission of the European Communities Publication EUR 8466 EN, 297–325.

SANCHEZ-VIZCAINOJ.M., MARTINEZ-LOPEZ B., MARTINEZ-AVILES M., MARTINS C., BOINAS B., VIAL L., MICHAUD V., JORI F., ETTER E., ALBINA E. & ROGER F. (2009). Scientific Review on African Swine Fever. CFP/EFSA/AHAW/2007/02, pp: 1–141.

VINUELA E. (1985). African swine fever. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 116, 151170.

WARDLEY  R.C., ABU  ELZEIN  E.M.E., CROWTHER  J.R. & WILKINSON  P.J. (1979).  A  solid-phase  enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of African swine fever antigen and antibody. J. Hyg., 83, 363369.

*** Oleh Drh Giyono Trisnadi, alih bahasa dari oie Terrestrial Manual dengan judul: African Swine Fever.

PENTING UNTUK PETERNAKAN: