Prosedur diagnostik
laboratorium untuk African Swine Fever dibagi ke dalam dua kelompok: yang
pertama berisi uji untuk isolasi virus, sedangkan yang kedua adalah uji untuk
deteksi antibodi. Pemilihan uji yang akan dilakukan semestinya tergantung pada
situasi penyakit dan kemampuan diagnosis laboratorium di daerah atau negara
terdampak.
RINGKASAN
African swine fever (ASF) atau Demam babi afrika adalah penyakit menular
pada babi ternakan dan babi liar dari semua bangsa (breed) babi dan semua usia,
yang disebabkan oleh virus yang menimbulkan berbagai gejala gejala (sindrom). ASF
akut ditandai dengan demam tinggi, perdarahan dalam sistem retikuloendotelial,
dan dengan tingkat kematian yang tinggi. Kutu kecil dari genus Ornithodoros,
terutama O. moubata dan O. erraticus, telah terbukti untuk menjadi reservoir
dan vektor penularan virus ASF (ASFV).
ASFV adalah satu-satunya anggota keluarga Asfarviridae, genus Asfivirus.
Prosedur diagnostik laboratorium untuk ASF dibagi ke dalam dua kelompok:
yang pertama berisi uji untuk isolasi virus dan deteksi antigen virus dan genomic
DNA, sedangkan yang kedua berisi uji untuk deteksi antibodi. Pemilihan uji yang
akan dilakukan tergantung pada situasi penyakit dan kemampuan diagnosis
laboratorium di daerah atau negara.
Identifikasi agen penyakit: diagnosa laboratorium harus diarahkan ke isolasi virus dengan cara
simultan melalui inokulasi leukosit babi atau kultur sumsum tulang, deteksi
antigen dalam apusan atau bagian cryostat jaringan dengan fluorescent antibody
test (FAT) dan deteksi DNA genom dengan polymerase chain reaction (PCR). PCR
adalah teknik yang sangat baik, sangat sensitif, dan cepat untuk deteksi ASFV
dan sangat berguna dalam berbagai situasi. Hal ini sangat berguna jika jaringan
tidak cocok untuk isolasi virus dan deteksi antigen.
Dalam kasus yang meragukan, material yang di pasase dalam kultur sel
leukosit dan prosedur yang dijelaskan di atas di ulang.
Uji serologis: Babi yang bertahan oleh infeksi alami biasanya mengembangkan antibodi
terhadap ASFV dari 7-10 hari pasca-infeksi dan antibodi ini bertahan untuk
jangka waktu yang lama. Di mana penyakit ini endemik, atau di mana wabah primer
disebabkan oleh strain virulensi rendah, penyelidikan wabah baru harus mencakup
deteksi antibodi spesifik dalam serum atau ekstrak dari jaringan yang diajukan.
Berbagai metode seperti uji indirect fluorescent antibody (IFA), uji enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA) dan uji imunoblotting yang tersedia untuk
mendeteksi antibodi.
Persyaratan untuk vaksin:
Saat ini, tidak ada vaksin untuk ASF.
PENDAHULUAN
Virus African swine fever (ASFV) adalah virus
DNA beramplop ikosahedral besar kompleks yang menunjukkan banyak fitur (wajah)
umum untuk kedua iridovirus dan familia poxvirus (Arias & Sánchez-Vizcaino,
2002a; Vinuela, 1985). Virus ini sekarang diklasifikasikan sebagai satu-satunya
familia yang disebut Asfarviridae (Dixon
et al., 2005). Setidaknya 28 struktur protein telah diidentifikasi dalam
partikel virus intraseluler (200 nm) (Sánchez-Vizcaino, 2006). Lebih dari
seratus protein infeksius telah diidentifikasi dalam makrofag babi yang
terinfeksi atau yang sembuh, dan setidaknya 50 dari mereka bereaksi dengan
serum dari babi yang terinfeksi atau yang sembuh. Virus genom terdiri antara
170 dan 192 kilobases (kb), dengan kelestarian daerah tengah sekitar 125 kb dan
akhir variabel. Daerah variable ini mengkodekan lima familia multigene yang
terlibat langsung dengan variabilitas genom virus (Blasco et al., 1989).
Analisis lengkap dari sequence beberapa strain ASFV telah dicapai (Chapman et
al, 2008;.. De Villier et al, 2010). Strain yang berbeda dari ASFV bervariasi
dalam kemampuan mereka untuk menyebabkan penyakit, tetapi saat ini hanya ada
satu serotipe virus yang diakui terdeteksi dengan tes antibodi.
Epidemiologi molekuler penyakit ini diselidiki dengan sequencing di akhir terminal C dari gen-VP72, yang dibedakan
hingga 22 genotipe yang berbeda (Boshoff et al, 2007;.. Lubisi et al, 2005). Sequencing
genom penuh gen-P54 telah dikonfirmasi sebagai metode genotip tambahan yang
berharga untuk studi epidemiologi molekuler (Gallardo et al., 2009). Peningkatan
pemisahan adalah diperoleh dengan menganalisis variabel daerah pusat (Central
Variable Region /CVR) dalam gen-B602L, digambarkan sebagai tempat paling variable
untuk membedakan antara isolat terkait erat dan mengidentifikasi subgrup virus
dalam beberapa dari 22 genotipe (Gallardo et al., 2009).
Virus ASF menghasilkan berbagai sindrom bervariasi dari perakut, akut
penyakit kronis dan pembawa virus yang tampak sehat. Babi adalah satu-satunya
spesies hewan domestik yang secara alami terinfeksi oleh ASFV. Celeng Eropa dan
babi liar juga rentan terhadap penyakit, menunjukkan gejala klinis dan tingkat
kematian serupa dengan yang diamati pada babi ternakan. Pada babi afrika liar
seperti warthogs (Phacochoerus aethiopicus), babi hutan (Potamochoerus porcus)
dan babi hutan raksasa (Hylochoerus meinertzhageni) tahan terhadap penyakit dan
menunjukkan sedikit atau tidak ada gejala gejala klinis. Spesies ini dari babi
liar berperan sebagai reservoir hospes dari ASFV di Afrika (Sánchez-Vizcaino,
2006).
Masa inkubasi di alam biasanya 4-19 hari. Strain virulesi ganas
menghasilkan peracute atau penyakit hemoragik akut ditandai dengan demam tinggi,
kehilangan nafsu makan, pendarahan di kulit dan organ, dan kematian pada 4-10
hari, kadang-kadang bahkan sebelum tanda-tanda klinis pertama yang diamati.
Tingkat kematian mungkin mencapai 100%. Strain virulensi kurang ganas menghasilkan
tanda-tanda klinis ringan - demam ringan, berkurangnya nafsu makan dan depresi
- yang dapat membingungkan dengan banyak kondisi lain pada babi dan barangkali menyebabkan
tidak curiga adanya ASF. Strain virulensi rendah, strain non-haemadsorbing
sesekali menghasilkan infeksi non-hemoragik terutama subklinis dan
serokonversi, tetapi beberapa hewan dapat mengembangkan lesi berbeda di
paru-paru atau pada kulit di daerah atas tonjolan tulang dan daerah lainnya
mengalami trauma. Hewan yang telah pulih dari infeksi baik akut atau kronis
dapat menjadi terus-menerus terinfeksi, bertindak sebagai pembawa virus. Alasan
/sebab biologis mengenai persistensi ASFV masih belum diketahui (Carrillo et
al., 1994). Babi yang sembuh dan sebagai pembawa ASFV dan babi hutan terinfeksi
secara persisten merupakan masalah terbesar dalam pengendalian penyakit ini.
Pengenalan serologis babi carier adalah hal vital bagi keberhasilan program
pemberantasan (Arias & Sánchez-Vizcaino, 2002b).
ASF tidak dapat dibedakan dari penyakit Classical Swine Fever
(hog cholera, CSF) dengan pemeriksaan klinis atau bedah mayat, dan kedua
penyakit harus dipertimbangkan dalam diagnosis banding dari setiap sindrom
perdarahan demam akut (acute febrile
haemorrhagic syndrome)
pada babi. Bakteri septicaemia juga dapat membingungkan terhadap diagnosa ASF
dan CSF. Tes laboratorium sangat penting untuk membedakan antara penyakit ini.
Di negara-negara yang terbebas dari ASF tapi mencurigai adanya penyakit
ini, diagnosis laboratorium harus diarahkan isolasi virus dengan secara simultan
melakukan inokulasi lekosit babi atau kultur sumsum tulang, deteksi antigen
dalam apus atau bagian cryostat jaringan dengan Fluorescent Antibody Test (FAT)
dan, dengan deteksi genom DNA dengan Polymerase Chain Reaction (PCR), yang
merupakan teknik yang paling sensitif untuk mendeteksi keberadaan agen pada
hewan terinfeksi persisten dan sangat berguna jika sampel yang dikirim tidak
cocok untuk isolasi virus dan deteksi antigen karena sampel tersebut telah
mengalami pembusukan. ASFV dapat dideteksi dengan PCR dari tahap yang sangat
awal infeksi pada jaringan, darah-EDTA (ethylene diamine tetra-acetic acid)
dan sampel serum. Babi yang sembuh dari infeksi akut atau kronis biasanya
menunjukkan viremia selama beberapa minggu membuat tes PCR sebagai alat yang sangat
berguna untuk mendeteksi DNA ASFV pada babi yang terinfeksi dengan strain virulensi
rendah atau sedang.
Karena tidak ada vaksin yang tersedia, adanya antibodi ASFV merupakan
indikasi infeksi sebelumnya dan, sebagai antibodi yang dihasilkan dari minggu
pertama infeksi dan bertahan untuk waktu yang lama, mereka adalah penanda yang
baik untuk diagnosis penyakit. Penampilan awal (dari 7 - 10 hari pasca-infeksi)
dan persistensi subsequen jangka panjang dari antibodi membuat teknik deteksi
antibodi, seperti ELISA, immunoblotting atau tes IFA, sangat berguna dalam
mendiagnosis subakut dan bentuk kronis penyakit ini.
Epidemiologi ASF adalah komplek dengan pola epidemiologi yang berbeda dengan
kejadian infeksi di Afrika dan Eropa. ASF terjadi melalui siklus transmisi yang
melibatkan babi ternakan, babi hutan, babi liar afrika, dan kutu (Sánchez-Vizcaino
et al., 2009). Di daerah dimana Ornithodorus kutu bertubuh lunak ada, deteksi
ASFV di reservoir infeksi memberikan kontribusi untuk pemahaman yang lebih baik
tentang epidemiologi penyakit. Ini adalah sangat penting dalam membangun
kontrol dan program pemberantasan yang efektif (Basto et al., 2006).
ASF bukanlah penyakit zoonosis dan tidak mempengaruhi kesehatan masyarakat
(Sánchez-Vizcaino et al., 2009).
ASFV harus ditangani di laboratorium yang telah disetujui oleh Otoritas
yang kompeten mereka setelah OIE pedoman untuk biocontainment Grup 3 dan 4
patogen.
B. TEKNIK DIAGNOSTIK
1. Identifikasi agen
Ketika ASF disangkakan, sampel sampel berikut harus dikirim ke
laboratorium: darah dalam antikoagulan (EDTA), limpa, kelenjar getah bening, tonsil
dan ginjal. Ini harus disimpan sedingin mungkin, tanpa pembekuan, selama
transit. Setelah sampel tiba di laboratorium, harus disimpan pada suhu - 70 ° C
jika pemrosesan akan ditunda. Karena mempertahankan rantai dingin tidak selalu
mungkin, sampel dapat disampaikan dalam glycerosaline; ini mungkin sedikit menurunkan
kemungkinan isolasi virus, tetapi dapat memfasilitasi pengajuan sampel ke
laboratorium sehingga wabah dapat dikonfirmasi.
Persiapan sampel untuk tes haemadsorpsi (haemadsorption)
i) Siapkan suspensi
jaringan dengan menggiling 0,5 - 1,0 g potong dengan alu dan lesung (pestle and mortar) yang mengandung pasir steril, kemudian
tambahkan 5 - 10 ml larutan garam buffer atau media kultur jaringan yang
mengandung antibiotik.
ii) Jernihkan
suspensi dengan sentrifugasi pada 1000 g selama 5 menit. Gunakan supernatan
untuk kultur sel /haemadsorption (Bagian B.1.a bawah).
a) Uji Haemadsorpsi
Uji haemadsorption (HAD) (Malmquist & Hay, 1960) didasarkan pada
kenyataan bahwa eritrosit babi akan melekat pada permukaan monosit babi atau
makrofag sel yang terinfeksi ASFV dan bahwa sebagian besar virus isolat
menghasilkan fenomena dari haemadsorption. Hasil positif dalam tes HAD adalah
definitif untuk diagnosis ASF. Sebuah jumlah yang sangat kecil dari virus
'non-haemadsorbing' telah diisolasi, yang sebagian besar adalah virulen, tapi
beberapa menghasilkan tipikal ASF akut. Pengujian dilakukan dengan inokulasi
darah atau jaringan suspensi dari tersangka babi ke dalam kultur leukosit
primer, (Prosedur 1 di bawah) atau ke alveolar kultur sel makrofag, dan juga
dengan menyiapkan kultur leukosit dari darah babi diinokulasi di laboratorium
atau dari darah dari babi terduga yang dikumpulkan di lapangan (Prosedur 2
bawah). Di atas 300 kultur dalam tabung dapat dibuat dari setiap 100 ml pengumpulan
darah terdefibrinasi. Hal ini penting untuk melaksanakan semua prosedur
sedemikian rupa untuk mencegah kontaminasi kultur.
Prosedur 1: Uji Haemadsorpsi
dalam kultur leukosit primer
i) Kumpulkan volume yang diperlukan dari darah babi segar
terdefibrinasi.
ii) Centrifuge pada 700 g selama 30 menit dan kumpulkan sel buffy coat.
Tambahkan tiga volume 0,83% amonium klorida dengan leukosit yang diperoleh.
Campur dan inkubasi pada suhu kamar selama 15 menit. Centrifuge pada 650 g
selama 15 menit dan hati-hati buang supernatan. Cuci pelet di media atau buffer
fosfat garam (PBS).
iii) Suspensi sel-sel pada konsentrasi 106-107 sel / ml dalam medium
kultur jaringan yang mengandung 10 - 30% serum babi dan antibiotik. Untuk
mencegah haemadsorption nonspesifik, media harus mengandung serum atau plasma
dari babi yang sama dari mana leukosit diperoleh. Jika banyak sampel yang akan
diuji, serum homolog dapat diganti dengan serum yang telah diidentifikasi
dengan pra-screening sebagai mampu mencegah pembentukan auto-roset spesifik.
iv) Bagikan suspensi sel dalam 96 - well plate (sumur plate) dengan 200 µl per well (300.000 sel /well) dan
inkubasikan pada suhu 37 ° C dengan kelembaban 5 % CO2 inkubator. Prosedur ini
juga dapat dilakukan dalam aliquot dari 1,5 ml dalam 160 × 16 mm tabung dan inkubasikan
dalam posisi miring (5-10 ° dari horisontal) pada 37 ° C.
Catatan: Untuk diagnosis rutin, hanya 2 - 4 hari umur kultur yang cukup
sensitif.
v) Setelah 3 hari inokulasi tiga tabung atau well plates dengan menambahkan 0,2 ml /tabung atau
0,02 ml (1/10 pengenceran akhir) /well (sumur) sampel dipersiapkan. Dianjurkan
untuk menginokulasi sepuluh kali lipat dan seratus kali lipat pengenceran ke
dalam kultur, dan ini sangat penting ketika material lapangan diserahkan dalam
kondisi yang buruk.
vi) Inokulasikan kultur yang positif dengan virus haemadsorbsi. Kontrol
negatif diinokulasi sangat penting untuk
memantau kemungkinan haemadsorpsi nonspesifik.
vii) Tambahkan 0,2 ml preparasi segar 1% eritrosit babi dalam buffer
salin ke masing-masing tabung. Dalam suatu kasus 96 well plate, tambahkan 0,02 ml 1%
erytrocytes babi per sumur (well).
ix) Pembacaan hasil: Haemadsorpsi terdiri dari alat tambahan sejumlah
besar eritrosit babi ke permukaan sel yang terinfeksi. Sebuah CPE terdiri dari
pengurangan jumlah sel ikutan dalam ketiadaan haemadsorpsi mungkin karena
sitotoksisitas pada inokulum, Virus penyakit Aujeszky atau non-haemadsorbing
ASFV, yang dapat dideteksi oleh FAT pada sedimen sel atau dengan menggunakan
PCR (lihat di bawah). Jika tidak ada perubahan yang diamati, atau jika hasil
imunofluoresensi dan PCR tes negatif, subinoculasi supernatan sampai tiga kali
dalam kultur leukosit segar. Semua isolasi harus dikonfirmasi dengan PCR dan
sekuensing.
Prosedur 2: Uji 'autorosette' Haemadsorption dengan leukosit darah
perifer dari babi yang terinfeksi
Prosedur ini lebih cepat dari pada preparasi dan inokulasi kultur primer
leukosit babi (dijelaskan dalam Prosedur 1 di atas) dan akan memberikan hasil
yang lebih cepat dalam kasus yang positif. Ini dapat dilakukan di laboratorium
yang tidak dilengkapi untuk pemeriksaan virologi rutin; persyaratan minimum slide dan cover slip, mikroskop dan media steril,
tabung atau botol dan pipet. Darah dari babi yang dicurigai di lapangan, atau
mereka (material) diinokulasi di laboratorium, dikoleksi dalam heparin dan kultur
leukosit dipersiapkan untuk pemeriksaan langsung untuk haemadsorpsi. Namun,
hasil tes sulit untuk dievaluasi dan sekarang digantikan oleh PCR.
i) Kumpulkan 20 ml darah (whole blood) dalam syring yang mengandung 2000
IU heparin dalam 2 ml saline, campur dan pindah ke tabung gelas atau botol yang
sempit.
ii) Tempatkan tabung /botol vertikal di dalam inkubator atau water bath pada
37° C, dan memungkinkan sel untuk memantapkan. Sedimentasi ditingkatkan dengan
penambahan 2 ml volume ekspander plasma, seperti 'Dextravan150' yang merupakan
solusi dari dekstran 150 di 0,9% NaCl untuk injeksi (Fisons, United Kingdom).
iii) Inkubasi kultur selama 6 - 8 jam pada 37° C, dan kemudian cek
kultur dengan interval 2 - 3 jam dengan mentransfer aliquot kecil dari white-cell-rich
supernatant, bersama-sama dengan beberapa
eritrosit, pada slide kaca.
iv) Pembacaan hasil: Kehadiran haemadsorbing sel diidentifikasi di bawah
mikroskop menunjukkan adanya ASFV. Haemadsorpsi terdiri dari ikutan sejumlah
besar eritrosit babi ke permukaan sel yang terinfeksi. Banyak bukti bahwa haemadsorpsi
akan menjadi cukup untuk mempertimbangkan pengulangan uji atau mengkonfirmasi
kehadiran ASFV dengan tes lain seperti PCR.
b) Deteksi Antigen dengan fluorescent antibody test
(FAT)
FAT (Bool et al., 1969) dapat digunakan sebagai metode tambahan untuk
mendeteksi antigen pada jaringan babi tersangka di lapangan atau yang
diinokulasi di laboratorium. FAT positif ditambah tanda-tanda klinis dan lesi
yang tepat dapat memberikan diagnosis dugaan ASF. Hal ini juga dapat digunakan
untuk mendeteksi antigen ASFV dalam kultur leukosit yang ada tanpa HAD teramati
dan dengan demikian dapat mengidentifikasi non-haemadsorbing strain virus. Hal
ini juga membedakan antara CPE yang diproduksi oleh ASFV dan diproduksi oleh
virus lain, seperti virus penyakit Aujeszky atau inokulum sitotoksik. Namun,
penting untuk dicatat bahwa dalam penyakit subakut dan kronis, FAT memiliki
signifikansi penurunan sensitivitas. Penurunan sensitivitas mungkin berhubungan
dengan pembentukan antigen antibody komplek dalam jaringan babi yang terinfeksi
yang menghalangi interaksi antara antigen ASFV dan konjugat ASF (Sánchez-Vizcaino,
2006).
Prosedur uji
i) Siapkan bagian cryostat atau pap smear pengujian jaringan, atau penyebaran
sedimen sel dari kultur inokulasi leukosit pada slide, udara kering dan fiksasi
dengan aseton selama 10 menit pada suhu kamar.
ii) Cat dengan fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated anti-ASFV
immunoglobulin
pada pengenceran yang direkomendasikan atau pretitrasi selama 1 jam pada suhu
37° C dalam kelembaban ruangan.
iii) Fiksasi dan cat kontrol positif dan negatif dengan preparasi yang
sama.
iv) Cuci dengan merendam empat kali dalam fresh PBS bersih, Pengecatan mount
stain jaringan dalam PBS /gliserol, dan periksa di bawah mikroskop dengan cahaya
ultraviolet dengan filter barier dan penguat (exciter) yang cocok.
v) Pembacaan hasil: Jaringan positif jika fluoresensi sitoplasma
granular tertentu teramati dalam jaringan organ limfoid paracortical atau
makrofag terfiksasi di organ lain, atau dalam kultur leukosit yang diinokulasi.
c) Deteksi virus genom dengan polymerase chain reaction (PCR)
Teknik PCR telah dikembangkan, menggunakan primer dari daerah yang
sangat dilestarikan genomnya, untuk mendeteksi dan mengidentifikasi berbagai
isolat milik semua genotipe virus yang dikenal, termasuk keduanya virus non haemadsorbing
dan isolat virulensi rendah. Teknik-teknik PCR sangat berguna untuk
mengidentifikasi virus DNA pada jaringan babi yang tidak cocok untuk isolasi
virus atau deteksi antigen karena mereka telah mengalami pembusukan, atau
ketika ada alasan yang baik untuk percaya bahwa virus mungkin telah dininaktifkan
sebelum sampel diterima di laboratorium.
Dua prosedur PCR tervalidasi dijelaskan dan terdiri dari persiapan
sampel diikuti dengan prosedur tes. Prosedur ini berfungsi sebagai pedoman umum
dan titik awal untuk prosedur PCR. Kondisi optimal reaksi (waktu inkubasi dan
suhu, model dan pemasok peralatan, konsentrasi reagen tes seperti primer dan
dNTP) dapat bervariasi sehingga kondisi yang dijelaskan harus dievaluasi terlebih
dahulu.
Prosedur Preparasi sampel
(Agüero et al, 2003;. 2004)
Prosedur ekstraksi sensitif menggunakan komersial template preparasi
tinggi PCR Kit 1 dijelaskan di bawah ini. Sejumlah kit ekstraksi DNA lainnya
yang tersedia secara komersial untuk pembuatan template yang cocok untuk PCR
tergantung pada sampel yang diajukan untuk analisis dan mungkin cocok untuk
digunakan. Sampel yang berbeda dapat digunakan dalam prosedur ini seperti
supernatan kultur sel, EDTA-darah, serum dan homogenasi jaringan, bahkan jika
yang terakhir telah disimpan dalam kondisi hangat dan mengalami tingkat
pembusukan. Prosedur ini memiliki keuntungan karena dapat digunakan untuk kedua
ekstraksi DNA ASFV dan CSFV RNA yang memungkinkan deteksi simultan dari kedua
virus pada multipleks PCR (Agüero et al., 2004).
Template preparasi murni tingi PCR Kit1 termasuk reagen berikut: Binding
Buffer, Proteinase K, Inhibitor Removal Buffer, Wash Buffer, dan tabung High
Pure Filter and tabung koleksi.
Untuk sampel organ dan jaringan, pertama siapkan 1/10 homogenat dari material
dalam PBS, kemudian centrifuge untuk menjernihkan pada 12.000 g selama 5 menit.
Ekstrak DNA /RNA dari cairan supernatan yang dihasilkan. Kadang-kadang
dianjurkan untuk memproses 1/10 pengenceran supernatan secara paralel.
Ekstraksi untuk sampel kontrol: setidaknya satu control positif dan satu
kontrol negatif harus disertakan dalam setiap melakukan ekstraksi asam nukletat.
Sampel kontrol positif harus 200 µl serum positip ASFV, EDTA-darah, atau 1/10
homogenat jaringan (sejenis jaringan sebagai sampel yang akan dianalisis):
kontrol negatif harus 200 µl air atau ASFV negatif EDTA- darah, atau homogenat
jaringan. Kontrol seharusnya diproses dengan sampel uji.
Preparasi larutan kerja
Lyophilised proteinase K: larut proteinase K dalam 4,5 ml air suling
steril, dan larutan aliquot dalam vial 500 µl.
Simpan pada -20° C sampai digunakan.
Inhibitor Removal Buffer: tambahkan etanol 20 ml pada vial aslinya. Sesuai
label dan tanggal botol.
Buffer pencuci: tambahkan etanol absolut 80 ml pada botol aslinya. Sesuai
label dan tanggal botol.
i) Pipet 200 ml dari sampel ke dalam tabung 1,5 ml microcentrifuge.
ii) Tambahkan 200 µl buffer
mengikat dan 40 µl proteinase K.
campur segera. Inkubasikankan selama 10 menit pada 72 ° C.
iii) Secara singkat centrifuge 1,5 ml tabung microcentrifuge untuk meremove
tetesan dari bagian dalam tutupnya.
iv) Tambahkan 100 ml isopropanol pada tabung sampel.
v) Tempatkan filter tabung murni (high pure) ke dalam tabung koleksi dan
pipet sampelnya di dalam reservoir atas. Sentrifus selama 1 menit pada 8000
rpm. (Dengan sampel darah, ulangi langkah sentrifugasi jika sampel tetap dalam
tabung filter.)
vi) Buang tabung pengumpulan dan tempatkan tabung filter ke dalam tabung
koleksi bersih.
vii) Tambahkan 500 ml Inhibitor Removal Buffer ke reservoir atas dan sentrifus
selama 1 menit pada 8000 rpm.
viii) Buang tabung pengumpulan dan menempatkan tabung filter ke dalam
tabung koleksi bersih.
ix) Tambahkan 450 µl larutan buffer pencuci ke reservoir atas dan sentrifus
selama 1 menit pada 8000 rpm.
x) Buang tabung koleksi dan ulangi langkah pencucian.
xi) Buang tabung koleksi dan tempatkan tabung filter ke dalam tabung
koleksi bersih. Sentrifus selama 10 detik pada 13000 rpm untuk menghilangkan
sisa penyangga mencuci.
xii) Buang tabung koleksi dan tempatkan tabung filter dalam 1,5 ml
microcentrifuge tabung bersih.
xiii) Untuk elusi asam nukleat, tambahkan 50 µl penghangat (70 ° C) air
steril ke reservoir atas (hati-hati untuk tidak menggunakan Buffer elusi
termasuk dalam kit untuk CSFV RNA). Centrifuge selama 1 menit pada 8000 rpm.
xiv) Gunakan segera atau simpan pada -20° C untuk penggunaan waktu yang
akan depan.
Amplifikasi PCR dengan PCR
konvensional (Agüero et al., 2003)
Set primer ASFV primer menjelaskan dalam prosedur ini dapat
dikombinasikan dengan satu set primer CSFV spesifik dalam multiplex metode
RT-PCR yang memungkinkan deteksi perbedaan dan simultan dari kedua genom virus
dalam reaksi tunggal (Agüero et al., 2004).
Larutan stok
Nuklease-bebas air steril.
Hot Star Taq Polimerase DNA, 10 × PCR Buffer II, dan magnesium klorida
yang ada di pasaran.
PCR nukleotida campuran yang mengandung 10 mM disetiap dNTP tersedia di
pasaran.
Marker DNA: 100 base-pair ladder
is commercially available.
Primer pada konsentrasi 20 pmol /µl: Primer PPA-1 sequence
5'-AGT-TAT-GGG-AAA-CCC-GAC- CC-3 '(forward primer); primer PPA-2 sequence
5'-CCC-TGA-ATC-GGA-GCA-TCC-T-3 '(reverse primer).
10 × loading buffer: 0,2% xylene cyanol, 0,2% bromophenol biru, 30%
gliserol.
TAE buffer (50 ×) untuk gel agarosa: Tris base (242 g); asam asetat
glasial (57,1 ml); 0,5 M EDTA, pH 8,0 (100 ml); air suling (1 liter).
Marker DNA: 100 base-pair ladder
tersedia di pasaran.
i) Dalam tabung microcentrifuge streril 1,5 ml persiapkan campuran
reaksi PCR dijelaskan di bawah untuk masing-masing sampel. Siapkan campuran
reaksi dalam jumlah besar untuk jumlah sampel yang akan diuji agar memungkinkan
untuk setidaknya satu sampel tambahan.
ii) Nuclease-bebas atau air suling steril (17,375 µl 10 × PCR Buffer II
(2,5 ml), magnesium klorida 25 mM (2 µl), dNTP mix 10mm (0,5 µl), primer PPA-1,
20 pmol /µl (0,25 µl), primer PPA-2, 20 pmol /µl (0,25 µl), Taq Gold DNA polymerase 5 U/µl (0.125 µl).
iii) Tambahkan 23 µl PCR reaction mix
pada sejumlah yang diperlukan untuk 0,2 ml tabung PCR.
iv) Tambahkan 2μl dari template sampel ekstraksi pada masing-masing
tabung PCR. Sertakan kontrol reaksi positip (2 µl ASFV DNA) dan kontrol reaksi negatif (2 ml air suling) pada
masing-masing PCR run.
v) Tempatkan semua tabung dalam thermal cycler otomatis dan jalankan
program berikut: Satu siklus pada 95° C selama 10 menit. 40 siklus pada 95° C
selama 15 detik, 62° C selama 30 detik dan 72° C selama 30 detik. Satu siklus
pada 72° C selama 7 menit. Tahan pada suhu 4° C.
vi) Pada akhir program, ambil tabung PCR dan tambahkan 2,5 ml dari 10 ×
buffer loading masing-masing tabung.
vii) Muat (load) semua sampel dalam gel agarosa 2% di buffer TAE yang
mengandung etidium bromida pada konsentrasi akhir 0,5 µg /ml.
viii) Tambahkan DNA penanda (marker) ke salah satu jalur di setiap sisi
gel.
ix) Jalankan (Run) gel pada tegangan konstan 150-200 volt selama sekitar
30 menit.
x) Pembacaan hasil: Periksa gel diatas sumber cahaya UV. Dalam sampel
positif, band diskrit akan terlihat yang harus bekerja bermigrasi dengan produk
PCR dari kontrol positif. Hitung ukuran produk PCR pada sampel uji dan kontrol
positif dengan mengacu pada standar penanda. Produk PCR dari kontrol positif
memiliki ukuran 257 pasangan basa. Tidak ada band terlihat dalam kontrol
negatif.
xi) Opsional: Sebuah uji konfirmasi tambahan bisa dilakukan oleh BsmA I
restriksi endonuklease pencernaan dari amplified produk. Untuk pengujian ini, inkubasikan
selama 2,5 jam pada 55° C total 5 µl dari produk amplified DNA dalam volume
akhir 20 ml campuran pencernaan: 2 ml 10 × buffer, 1 µl BsmA I (5 U /µl) dan 12
µl air suling steril. Kemudian, jalankan (run) sampel dalam gel agarosa 3%
seperti dijelaskan di atas. Pola pembatasan harus mencakup dua fragmen dari
173-177 dan 84-80 pasangan basa dalam sampel positif.
Prosedur PCR: TaqMan®
protokol PCR (King et al, 2003).
Persiapan sampel
Sejumlah kit ekstraksi DNA yang tersedia di pasaran untuk pembuatan
template yang cocok untuk PCR tergantung pada sampel diajukan untuk analisis
dan mungkin cocok untuk digunakan di Laboratorium Referensi.
The QIAamp® Viral RNA Mini Kit (QIAGEN) prosedur (protokol spin)
dijelaskan di bawah ini. Kit ini dapat digunakan untuk darah dari hewan yang
diduga swine fever.
Darah dari babi yang terinfeksi harus diambil di EDTA. Deteksi ASFV dapat
dilakukan secara paralel dengan virus CSF (lihat Bab 2.8.3 untuk CSFV metode
deteksi molekuler).
i) Pipet 560 µl buffer yang disediakan AVL ke dalam tabung 1,5 ml
microcentrifuge.
ii) Tambahkan 140 µl tes atau kontrol sampel dan
campur dengan vortex selama sekitar 15 detik. Sampel kontrol ASF negatif yang
terdiri dari homogenat limpa dari babi tak terinfeksi dan sel sumsum tulang
babi (Porcine bone marrow = PBM) tidak terinfeksi dan mononuklear darah perifer
(Porcine blood mononuclrear = PBL) tidak terinfeksi harus diproses bersama
sampel uji. Ekstraksi tambahan kontrol negatif juga dapat dipersiapkan untuk
setiap sampel uji dan kontrol negatif terinfeksi dengan menjalankan (running)
ekstraksi paralel dari air (nuclease-bebas) (semua kontrol di subsekuense dengan
diuji dengan prosedur PCR bersama dengan sampel uji).
iii) Inkubasi pada suhu kamar setidaknya selama 10 menit.
iv) Secara singkat centrifuge tabung 1,5 ml microcentrifuge untuk
menghilangkan tetes dari bagian dalam tutupnya.
v) Tambahkan 560 µl etanol pada
sampel, vortex selama kurang lebih 15 detik dan sebentar centrifuge untuk
menghapus tetes dari bagian dalam tutupnya.
vi) Tambahkan 630 ml larutan dari v) ke kolom spin QIAamp (dalam tabung
koleksi 2-ml) tanpa membasahi RIM. Tutup capnya dan centrifuge selama 1 menit
pada 6000 g. Tempatkan kolom spin ke dalam 2 ml koleksi tabung bersih dan buang
tabung yang berisi filtrat.
vii) Hati-hati membuka kolom spin QIAamp dan ulangi langkah vi.
viii) Hati-hati membuka kolom berputar QIAamp dan tambahkan 500 µl Buffer
AW1. Tutup penutupnya dan centrifuge selama 1 menit pada 6000 g. Tempatkan
kolom spin ke dalam 2 ml tabung koleksi bersih dan membuang tabung yang berisi
filtrat.
ix) Hati-hati membuka kolom spin QIAamp dan tambahkan 500 ml Buffer AW2.
Tutup penutupnya dan centrifuge selama 3 menit pada 20.000 g.
x) Tempatkan kolom spin QIAamp dalam tabung 1,5 ml microcentrifuge baru.
Buang tabung koleksi lama yang mengandung filtrat. Hati-hati membuka kolom spin
QIAamp dan tambahkan 60 ml Buffer AVE. Tutup penutupnya dan inkubasi pada suhu
kamar selama 1 menit. Centrifus selama 1 menit pada 6000 g.
xi) Buang kolom spin QIAamp berputar. Simpan ekstrksian DNA (60 ml) pada
-20° C sampai diperlukan untuk prosedur amplifikasi PCR.
Larutan stok
i) Nuclease bebas atau air steril lain yang sesuai dan TaqMan® PCR
campuran master reaksi (2 ×).
ii) Primer pada konsentrasi 50 pmol /µl:
Primer 1 seqquence 5'-CTGCT-CATGG-TATCA-ATCTT-ATCGA-3 '(stran positif); Primer 2
urutan 5'-GATAC-CACAA-GATC (AG)-GCCGT-3 '(strand negatif).
iii) TaqMan®
probe pada konsentrasi 5 pmol /µl: (5 '- [6-karboksi-fluorescein (FAM)]-CCACG-GGAGG-AATAC-CAACC-CAGTG-3' - [6-karboksi-tetrametil-rhodamine (TAMRA)]).
Amplifikasi PCR dengan TaqMan®
assay (Fernández-Pinero et al., 2010)
i) Dalam tabung steril 1,5 ml microcentrifuge persiapkan campuran reaksi
PCR dijelaskan di bawah untuk masing-masing sampel. Siapkan campuran reaksi
dalam jumlah besar untuk jumlah sampel yang akan diuji, tetapi memungkinkan
untuk satu sampel tambahan.
Nuklease bebas atau air steril (7,5 µl); (2 × conc.) TaqMan® PCR reaksi
master mix (12,5 ml); primer 1, 50 pmol (1,0 µl); primer 2, 50 pmol (1,0 µl); TaqMan®
probe, 5 pmol (1 µl).
ii) Tambahkan 22 µl campuran reaksi PCR pada well plate reaksi optik
MicroAmp® untuk setiap sampel yang akan diuji.
iii) Tambahkan 3 µl pada Template sampel ekstraksi atau kontrol
ekstraksi kosong dan amankan dengan menutupi setiap wellnya (sumurnya).
iv) Putar piring selama 1 menit dalam centrifuge yang cocok untuk mencampur
isi dari setiap wellnya.
v) Tempatkan piring di TaqMan® sequence Detection System untuk amplifikasi
PCR dan jalankan (run) program berikut:
Satu siklus pada 50° C selama 2 menit, Satu siklus pada 95° C selama 10
menit, Empat puluh siklus pada 95° C selama 15 detik, 58° C selama 1 menit.
Catatan: Jika TaqMan® termal cycler tidak tersedia, thermal cycler biasa
dapat digunakan dan produk PCR dianalisa dengan pembacaan fluoresensi titik
akhir atau dengan alternatif memakai elektroforesis pada gel agarosa 1,5%.
Sebuah produk dari 250 bp yang diharapkan.
vi) Pembacaan hasil: Menetapkan siklus ambang batas (CT) nilai setiap
reaksi PCR dari scan semua plot amplifikasi (plot sinyal fluoresensi
dibandingkan jumlah siklus). Sampel tes negatif, tidak terinfeksi negatif atau control
kosong ekstraksi harus memiliki nilai CT> 40,0. Sampel uji yang positif dan
kontrol harus memiliki nilai CT <40,0 (sampel sangat positif memiliki nilai
CT <30,0).
Modifikasi protokol ini menggunakan berbagai kit amplifikasi komersial
dapat memberikan hasil PCR yang lebih tinggi, namun kit amplifikasi ini harus
sepenuhnya divalidasi sebelum digunakan.
2. Tes serologis
Antibodi bertahan pada babi yang sembuh untuk waktu yang lama setelah
infeksi, kadang-kadang untuk hidup, dan sejumlah tes sudah ada untuk mendeteksi
antibodi ini, meskipun hanya beberapa dari mereka telah dikembangkan untuk
penggunaan rutin di laboratorium diagnostik (Escribano et al., 1990; Pastor et
al, 1990;. Sánchez-Vizcaino, 1987). Yang paling umum digunakan adalah ELISA
(Sánchez-Vizcaino et al, 1983;. Wardley et al, 1979.), Yang cocok untuk
memeriksa baik serum atau cairan dari jaringan. Pengujian konfirmasi sampel
ELISA positif harus dilakukan dalam kasus-kasus penting menggunakan tes
alternatif, seperti tes IFA, pewarnaan immunoperoxidase atau imunoblotting
(Escribano et al, 1990;. Pastor et al, 1989.). Antibodi biasanya tidak
terdeteksi pada babi yang terinfeksi ASFV yang virulen karena mereka mati
sebelum diproduksi. Antibodi diproduksi pada babi yang terinfeksi virus ASF yang
virulensinya rendah atau cukup mematikan, tetapi ini bukan sepenuhnya antibody
netralisasi.
Baru-baru ini, sebuah studi ekstensif yang dilakukan untuk menilai
kekhususan dan sensitivitas tes serologi ASF dalam skenario epidemiologi yang
berbeda Afrika dan Eropa, dengan saat ini beredar isolat ASFV (termasuk
genotipe Kaukasia II dan isolat Afrika Timur menunjukkan variabilitas lebih),
telah menunjukkan bahwa tes yang ditentukan OIE dapat mendeteksi dengan akurasi
dan sensitivitas tinggi adanya antibodi ASF di semua situasi epidemiologi yang dievaluasi
(Gallardo et al., 2010).
Ketika ASF endemik, konfirmasi kasus dugaan penyakit yang terbaik adalah
dilakukan dengan menggunakan tes standar serologi (ELISA), dikombinasikan
dengan tes serologi alternatif (IFA) atau tes antigen-deteksi. Di beberapa
negara, lebih dari 95% dari kasus positif telah diidentifikasi menggunakan
kombinasi tes IFA dan FAT (Sánchez-Vizcaino, 2006).
Perlu dicatat bahwa ketika babi telah terinfeksi isolat avirulen atau
dari virulensi rendah, tes serologi mungkin satu-satunya cara untuk mendeteksi
hewan yang terinfeksi.
a) Enzim-Linked Immunosorbent Assay (tes ditetapkan untuk perdagangan
internasional)
ELISA (Pastor et al., 1990) adalah tes langsung yang dapat mendeteksi
antibodi terhadap ASFV pada babi yang telah terinfeksi oleh virus yang virulensinya
rendah atau sedang. Sebuah kit ELISA komersial yang sangat sensitif dan
spesifik berdasarkan format kompetisi yang telah divalidasi untuk digunakan
dalam situasi epidemiologi yang berbeda sudah tersedia dipasaran. Sebuah
alternatif yang lebih murah adalah dengan menyiapkan larutan antigen untuk
digunakan pada indirect ELISA, dan prosedur penggunaan larutan antigen ini
dijelaskan di bawah ini.
ELISA menunjukkan sensitivitas menurun ketika sampel serum yang akan
diuji diawetkan secara jelek. Untuk mengatasi masalah ini, beberapa ELISA-base
baru dalam penggunaan ASFV protein rekombinan baru sekarang sedang divalidasi
(Gallardo et al., 2006).
Melaksanakan tes konfirmasi kedua seperti tes imunoblotting, tes IFA
atau tes immunoperoxidase dijelaskan di bawah dianjurkan dalam kasus dengan hasil
yang diragukan atau hasil positif ketika sera yang diduga dengan pengawetan
yang jelek.
Persiapan Antigen untuk
ELISA
Antigen ELISA disiapkan dari pertumbuhan sel terinfeksi dari serum babi (Escribano
et al., 1989).
i) Sel MS (monkey stable) terinfeksi pada banyaknya infeksi 10 virus teradaptasi,
dan diinkubasi pada media yang mengandung 2% serum babi.
ii) Panen sel-sel pada 36-48 jam pasca-infeksi, ketika CPE meluas. Cuci
di PBS, sedimen pada 650 g selama 5 menit, cuci pelet sel dalam 0,34 M sukrosa
pada 5 mM Tris / HCl, pH 8,0, dan centrifuge pada pelet sel.
Lakukan langkah-langkah (iii) ke (v) di atas es:
iii) Resuspesi pelet sel dalam 67 mM sukrosa pada 5 mM Tris / HCl, pH
8,0 (1,8 ml per 175 cm2 flask), dan biarkan selama 10 menit dengan menggoncangka
setelah 5 menit.
iv) Tambahkan nonionik Nonidet deterjen P-40 ke konsentrasi akhir 1% (w
/ v), dan biarkan selama 10 menit (dengan menggoncangka setelah 5 menit) untuk
melisiskan sel.
v) Tambahkan sukrosa sampai konsentrasi akhir 64% (b / b) dalam 0,4 M
Tris /HCl, pH 8,0, dan centrifuge pada 1000 g selama 10 menit untuk inti pelet.
vi) Kumpulkan supernatan dan menambahkan EDTA (konsentrasi akhir 2 mM),
beta-mercaptoethanol (konsentrasi akhir 50 mM) dan NaCl (0,5 M konsentrasi
akhir) di 0,25 mM Tris /HCl, pH 8,0, dan inkubasikan selama 15 menit pada 25°
C.
vii) Sentrifus 100.000 g selama 1 jam pada suhu 4° C di atas layer 20%
(b / b) sukrosa dalam 50 mMTris / HCl, pH 8,0. Hapus band tepat di atas lapisan
sukrosa dan digunakan sebagai antigen ELISA. Simpan pada -20 ° C.
Prosedur Indirect ELISA
(Pastor et al., 1990)
i) Coat ELISA polysorp piring microtiter (s) dengan antigen dengan
menambahkan 100 ml dari yang direkomendasikan atau pretitrasi pengenceran
antigen dalam 0,05 M karbonat /buffer bikarbonat, pH 9,6, masing-masing well
(sumur).
ii) Inkubasikan pada suhu 4 ° C selama 16 jam (semalam) dan kemudian
cuci lima kali dengan 0,05% Tween 20 di PBS, pH 7,2.
iii) Encerkan serum tes dan serum kontrol positif dan negatif 1/30 pada
0,05% Tween 20 dalam PBS, pH 7,2, dan tambahkan 100 ml masing-masing serum
diencerkan untuk menduplikasi well (sumur) plate coated antigen (s).
Jika empat pasang setiap kontrol serum positif dan negatif ditambahkan
ke well di berbagai bagian plate, 40 sera dapat diuji dalam duplikat pada satu
piring, seperti yang ditunjukkan pada rencana pelat bawah:
|
+
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
-
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
-
|
|
|
|
|
+
|
|
|
|
|
-
|
|
|
|
|
|
|
|
+
|
|
|
|
|
-
|
|
|
|
|
|
|
|
-
|
|
|
|
|
+
|
|
|
|
|
|
|
|
-
|
|
|
|
|
+
|
|
|
|
|
-
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
+
|
|
-
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
+
|
iv) Inkubasikan plate pada 37 ° C selama 1 jam (opsional pada shaker plate),
dan kemudian cuci lima kali dengan 0,05% Tween 20 di PBS.
v) Untuk masing-masing well tambahkan 100 ml protein-A /konjugat horseradish
peroxidase (Pierce) pada larutan pretitrasi yang direkomendasikan pada 0,05%
Tween 20 dalam PBS.
vi) Inkubasikan plate pada 37 ° C selama 1 jam, kemudian cuci lima kali
dengan 0,05% Tween 20 dalam PBS.
vii) Substrat: Tambahkan hidrogen peroksida untuk larutan substrat
(0,04% orthophenylenediamine (OPD) dalam fosfat /buffer sitrat, pH 5.0) sebesar
10 µl/ 25 ml, dan tambahkan 100 ml substrat pada masing-masing well (sumur).
Atau, DMAB / MBTH larutan substrat dapat digunakan sebagai pengganti
OPD: Tambahkan 200 µl substrat pada setiap
well (10 ml larutan DMAB 80,6 mM + 10 ml larutan MBTH1.56mM + 5 ml H2O2).
DMAB /MBTH substrat preparasi:
DMAB - 3-Dimethylaminobenzoic acid (SIGMAD-07871643); MBTH -
3-Methyl-2-benzothiazolinone hidrazon hidroklorida monohidrate (SIGMA M-8006).
Larutan DAMB 80,6 mM: Larutkan 13,315 g asam DAMB 1000 ml dalam 0,1 M
buffer fosfat, pH 7 (5,3 g KH2PO4, 8.65 g Na2HPO4 dibuat sampai 1000 ml dalam
air suling) dengan goncangan kontinyu selama 1 jam pada suhu kamar, sesuaikan
pH 7 dengan NaOH (5 M). Saring melalui corong.
Larutan MBTH 1,56 mM: Larutkan 0,3646 g MBTH 1000 ml 0,1 M buffer
fosfat, pH 7 (5,3 g KH2PO4, 8,65 g Na2HPO4 dibuat sampai 1000 ml dalam air
suling) dengan goyangan kontinyu selama 1 jam, sesuaikan pH 6,25 untuk dengan
asam klorida pekat. Saring melalui corong.
Volume yang dibutuhkan per plate adalah: 10 ml DMAB + 10 ml + 5 ml MBTH
H2O2 30% Substrat dapat disiapkan sebagai larutan stok, aliquoted dan disimpan
pada -20 ° C. Campur DAMB dan arutan MBTH (1/1) sebelum digunakan dan tambahkan
jumlah yang diperlukan dari 30% H2O2.
viii) Inkubasikan pada suhu kamar selama kurang lebih 6-10 menit
(sebelum kontrol negatif mulai berwarna). Waktu yang diperlukan warna untuk
mengembangkan akan tergantung pada kedua suhu substrat ketika ditambahkan ke well
plate, dan suhu kamar.
ix) Hentikan reaksi dengan menambahkan 100 µl asam sulfat 3 N pada
masing-masing well.
x) Pembacaan hasil: sera positif memiliki warna
yang jelas (kuning dalam kasus OPD substrat, biru dalam kasus DMAB / MBTH
substrat) dan dapat dibaca oleh mata, tetapi untuk memastikan bahwa semua sera
positif diidentifikasi, maka perlu membaca absorbansi pada setiap well
spektrofotometri, pada 492 nm (OPD substrat) atau 600-620 nm (dalam kasus DMAB
/ MBTH), dalam sebuah pembaca ELISA. Menggunakan substrat OPD serum setiap
dianggap positif jika memiliki nilai absorbansi lebih dari dua kali nilai
absorbansi rata-rata dari serum kontrol negatif di piring itu. Menggunakan DMAB
/ MBTH substrat, tes divalidasi ketika nilai absorbansi rata-rata dari kontrol
positif lebih dari empat kali rata-rata absorbansi kontrol negatif.
Untuk benar menginterpretasikan hasil perlu untuk menghitung titik
cut-off yang memungkinkan diferensiasi hasil negatif, tidak meyakinkan dan
positif. Cut-off point didapat oleh persamaan berikut:
Cut-off = density Optik density serum negatif × 1 + densitas optik serum
positif × 0,2.
- Sera dengan densiti optik bawah cut-off - 0,1 dapat dianggap negatif.
- Sera dengan densiti optik lebih tinggi dari cut-off + 0.1 dapat
dianggap positif.
- Sera dengan densiti optik antara cut-off ± 0,1 dapat dianggap tidak
meyakinkan dan hasilnya perlu dikonfirmasi oleh teknik IB.
b) Uji antibodi indirek fluorescent
Tes ini (Pan et al., 1974) seharusnya digunakan sebagai tes konfirmasi
untuk sera dari daerah yang bebas dari ASF dan positif dalam ELISA, dan sera
dari daerah endemis yang memberikan hasil yang tidak meyakinkan dalam ELISA.
Prosedur uji
i) Siapkan suspensi sel ginjal babi atau monyet trinfeksi ASFV pada
konsentrasi 5 × 105 sel /ml, spray tetes kecil pada slide kaca, kering udara
dan fiksasi dengan aseton pada suhu kamar selama 10 menit. Perhatikan bahwa
slide dapat disimpan pada -20 ° C sampai siap untuk digunakan.
ii) Panaskan sera tes yang negatif pada 56 ° C selama 30 menit.
iii) Tambahkan pengenceran yang tepat dari sera tes dan sera kontrol positif
dan negatif dalam buffer salin ke slide kedua sel kontrol yang terinfeksi dan
tidak terinfeksi, dan inkubasi selama 1 jam pada suhu 37 ° C dalam ruang yang lembab.
iv) Cuci slide dengan cara merendam empat kali dalam PBS segar segar dan
kemudian dengan air suling.
v) Tambah dengan pengenceran yang telah ditentukan atau direkomendasikan
konjugat anti-babi imunoglobulin /FITC atau konjugat protein-A /FITC ke semua
slide, dan inkubasikan selama 1 jam pada suhu 37° C dalam ruangan lembab.
vi) Cuci slide dengan cara merendam empat kali dalam PBS bersih segar
dan kemudian dengan air suling, dalam PBS /gliserol, dan periksa di bawah
mikroskop cahaya ultraviolet dengan barrier yang sesuai dan filter exciter.
vii) Pembaca hasil: Kontrol serum positif pada sel yang terinfeksi harus
positif dan semua kontrol lainnya harus negatif sebelum tes dapat dibaca. Sera
yang positif jika kultur terinfeksi menunjukkan fluoresensi spesifik.
c) Uji Immunoblotting (Escribano et al, 1990;.. Pastor et al, 1989)
Tes ini harus digunakan sebagai alternatif untuk tes IFA untuk
mengkonfirmasi hasil samar-samar dengan sera individu. Tes imunoblotting sangat
spesifik dan memungkinkan interpretasi dengan mudah dan lebih objektif dari
hasil dan pengakuan yang lebih baik dari sampel positif-lemah.
Protein virus yang menimbulkan antibodi spesifik pada babi telah
ditentukan. Polipeptida ini telah ditempatkan pada strip antigen dan telah
ditunjukkan dalam tes imunoblotting untuk bereaksi dengan antibodi dari 9 hari
pasca-infeksi.
Persiapan strip antigen
i) Siapkan cytoplasmic soluble virus proteins
sesuai yang dijelaskan untuk persiapan antigen ELISA dalam Bagian B.2.a.
ii) Electrophorese sampai 17% akril-amida / N, N'-diallyltartardiamide
(DATD) gel dengan standar berat molekul yang sesuai.
iii) Transfer protein ke membran nitroselulosa 14 × 14 cm2 dengan
elektroforesis pada arus konstan dari 5 mA /cm dalam buffer transfer (20%
metanol dalam 196 mM glisin, 25 mMTris / HCl, pH 8.3).
iv) Keringkan membran dan label sisi di mana protein dielektroforesis.
v) Potong satu strip dari tepi filter dan laksanakan prosedur
imunoblotting sesuai dijelaskan di bawah. Identifikasi daerah yang mengandung
protein 23-35 kDa dibandingkan dengan standar berat molekul dijalankan (run) secara
paralel, dan potong daerah ini menjadi 0,5 cm strip lebar. Label setiap strip
di sisi di mana protein dielektroforesis.
Strip ini (sekitar 4 cm panjangnya) merupakan strip antigen yang
digunakan untuk imunoblotting dan mengandung protein dengan antibody yang mana
di kedua sera akut dan babi sembuh akan bereaksi. Antibodi ini persisten (bertahan)
hidup di beberapa babi.
Persiapan larutan substrat
chloranaphthol.
Larutan ini harus disiapkan segera sebelum digunakan.
i) Larutkan 6 mg 4-chloro-1-naftol dalam 2 ml metanol dan tambahkan
larutan ini perlahan-lahan sampai 10 ml PBS sambil diaduk.
ii) Lepaskan endapan putih yang terbentuk dengan penyaringan melalui
Whatman No.1 kertas saringan (opsional).
iii) Tambahkan 4 µl 30% hidrogen
peroksida.
Prosedur uji
Strip antigen harus
dijaga dengan melabel sisi paling atas selama prosedur immunoreaction.
i) Inkubasi strip
antigen dalam buffer blocking (susu kering 2% non-lemak dalam PBS) pada suhu 37
° C selama 30 menit dengan goyangan kontinyu kontinyu.
ii) Siapkan 1/40
pengenceran tes sera dan sera control positif dan negatif dalam buffer
blocking.
iii) Inkubasikan
strip antigen dalam serum yang tepat pada 37° C selama 45 menit dengan
penggoyangan (agitasi) kontinyu. Inkubasikan satu strip antigen dalam serum
control positip dan satu di serum kontrol negatif. Kedua strip adalah kontrol.
Cuci empat kali dalam buffer blocking; pencucian akhir sebaiknya selama 5 menit
dengan goyangan (agitasi) kontinyu.
iv) Tambahkan
protein-A /konjugat horseradish peroxidase di pengenceran yang direkomendasikan
atau pretitrasi (biasanya pada 1/1000 pengenceran) dalam buffer blocking untuk
semua strip antigen. Inkubasikan pada suhu 37° C selama 45 menit dengan
goyangan (agitasi) kontinyu. Cuci empat kali dalam buffer blocking; pencucian
akhir harus selama 5 menit dengan digoyang kontinyu.
v) Siapkan larutan
substrat, tambahan strip antigen, dan inkubasikan pada suhu kamar selama 5 - 15
menit dengan digoyang (agitasi) kontinyu.
vi) Hentikan reaksi
dengan air suling ketika protein band gelap.
vii) Pembacaan hasil:
Reaksi sera positip dengan lebih dari satu protein virus di strip antigen;
mereka harus memberikan pola protein yang sama dan memiliki intensitas warna
yang sama sebagai stain strip antigen dengan control serum positif serum.
C. PERSYARATAN VAKSIN
Saat ini tidak ada
vaksin untuk ASF (Afrcan Swine Fever).
DAFTAR PUSTAKA
AGÜERO M., FERNÁNDEZ J., ROMERO L., SANCHEZ C., ARIAS M. & SÁNCHEZ-VIZCAÍNO J.M. (2003). Highly sensitive
PCR assay for the routine diagnosis of African
swine fever virus in clinical samples,
J
.Clin. Microbiol.,
41 (9),4431–4434.
AGÜERO M., FERNÁNDEZ
J., ROMERO L., ZAMORA M.J.,
SANCHEZ C., BELÁK S., ARIAS M. & SÁNCHEZ-VIZCAÍNO J.M. (2004).
A highly sensitive and specific
gel-based multiplex RT-PCR assay for the simultaneous and differential
diagnosis of African swine
fever
and Classical swine fever.
Vet. Res., 35, 1–13.
ARIAS M. & SÁNCHEZ-VIZCAÍNO J.M. (2002a). African swine fever. In: Trends in Emerging Viral Infections of Swine, Iowa State
University press, pp
119–124.
ISBN 0813803837.
ARIAS M. & SÁNCHEZ-VIZCAÍNO J.M. (2002b). African
swine fever eradication:
the Spanish model. In: Trends in
Emerging Viral Infections of Swine,
Iowa
State
University Press, pp 133–139. ISBN 0813803837.
BASTO A.P.,
PORTUGAL R.S., NIX
R.J., CARTAXEIRO
C., BOINAS
F., DIXON L.K.,
LEITAO A. & MARTINS C. (2006). Development of a nested PCR and its internal control for the detection of African swine fever virus (ASFV) in
Ornithodoros
erraticus. Arch. Virol., 151 (4), 819–826.
BLASCO R., AGÜERO M., ALMENDRAL
J.M. & VIÑUELA E. (1989). Variable and constant region in African
swine fever
virus DNA. Virology, 168, 330–338.
BOOL P.H., ORDAS A.
& SANCHEZ BOTIJA C. (1969). El diagnostico de la peste porcina africana por inmunofluorescencia.
(The diagnosis of African swine
fever by immunofluorescence).
Bull. OIE, 72,
819–839.
BOSHOFF C.I.,
BASTOS A.D.,
GERBER L.J.
&VOSLOO W. (2007).Genetic characterisation of African swine fever
viruses from outbreaks in southern Africa (1973–1999).Vet.Microbiol.,121 (1–2), 45–55.
CARRILLO C., BORCA M.V., AFONSO C.L.,
ONISK D.V. & ROCK D.L. (1994). Long-term persistent infection of swine monocytes/macrophages with African
swine fever virus.J. Virol., 68,
580–583.
CHAPMAN D.A., TCHEREPANOV
V., UPTON C. & DIXON L.K (2008).Comparison of the genome sequences of non-
pathogenic and pathogenic
African swine fever
virus isolates. J.Gen. Virol.,
89,
397–408.
DEVILLIER E.P., GALLARDO
C., ARIAS M.,DA SILVA M.,UPTON C., MARTIN R. & BISHOP R.P. (2010). Phylogenomic analysis of 11 complete African swine fever
virus genome sequences.Virol., 400 (1), 128–136.
DIXON L.K., ESCRIBANO J.M., MARTINS
C., ROCK D.L., SALAS
M.L. & WILKINSON P.J.
(2005). In: Virus Taxonomy, VIIIth
Report of the ICTV, Fauquet C.M., Mayo M.A., Maniloff
J, Desselberger U.& Ball L.A., eds. Elsevier/Academic
Press, London, UK. 135–143.
ESCRIBANO J.M., PASTOR M.J., ARIAS M. &
SANCHEZ VIZCAINO J.M. (1990). Confirmación de sueros positivos
a ELISA-peste porcina
africana, mediante la técnica de ‘Immunoblotting’. Utilización
de las proteínas inducidas por el virus con pesos moleculares comprendidos entre 23
y 35 kilodaltons, en el
desarrollo de un ‘kit’ de diagnóstico. (Confirmation of sera positive by ASF ELISA with the immunoblotting technique. Use of virus-induced proteins of 23–25
kDa in the development
of a diagnostic kit.) Med. Vet.,
7, 135–141.
ESCRIBANO J.M., PASTOR M.J. & SANCHEZ
VIZCAINO J.M. (1989). Antibodies to bovine serum albumin in swine sera: implications for false positive reactions in the sero diagnosis of African swine fever. Am. J. Vet. Res.,50, 1118–1122.
FERNÁNDEZ-PINERO J., GALLARDO C., ELIZALDE M., RASMUSSEN
T.B., STAHL K., LOEFFEN W., BLOME S., BATTEN
C., CROOKE H., LE POTIER M.F.,UTTENTHAL
Å., LEBLANC N., ALBINA E., KOWALCZYK A., MARKOWSKA-DANIEL I., TIGNON M., DE MIA G.M., GIAMMARIOLI M., ARIAS M. & HOFFMANN
B. (2010). EPIZONE ring trial on ASFV real-time
PCR. Annual Meeting of National
African Swine Fever Laboratories, 18 May 2010,
Pulawy, Poland.
GALLARDO C., BLANCO E., RODRÍGUEZ M.J.,
CARRASCOSA A. & SANCHEZ-VIZCAINO J.M. (2006).
Antigenic properties
and diagnostic potential of
African swine fever virus protein pp62 expressed in insect
cells. J. Clin.
Microbiol., 44 (3), 1489–1495.
GALLARDO C., MWAENGO D.M., MACHARIA J.M., ARIAS M., TARACHA E.A., SOLER A., OKOTH E., MARTÍN E.,
KASITI J.& BISHOP RP.(2009). Enhanced discrimination of African swine fever virus isolates through nucleotide sequencing of
the p54, p72, and pB602L
(CVR) genes. Virus Genes, 38 (1), 85–95.
GALLARDO C., SOLER A., SIMÓN A., MARTÍN E., MARTÍN R., PELAYO V.,OKOTH E.,BISHOP R., SÁNCHEZ M.A., DE MIA
G.,FASINA F.O., SÁNCHEZ-VIZCAÍNO, J.M. & ARIAS M.(2010).
African Swine Fever Threat: Evaluating diagnostic tools with ASFV circulating strains. Annual Meeting of National African Swine Fever Laboratories, 18 May 2010, Pulawy, Poland.
KING D.P., REID S.M., HUTCHINGS G.H., GRIERSON S.S.,
WILKINSON P.J., DIXON L.K., BASTOS A.D.S. & DREW T.W. (2003). Development of a TaqMan® PCR assay with internal amplification control for the detection of African swine fever virus. J. Virol. Methods, 107, 53–61.
LUBISI B.A., BASTOS A.D., DWARKA R.M. & VOSLOO W.(2005).Molecular epidemiology of African swine fever in East Africa. Arch Virol., 150
(12), 2439–2452.
MALMQUIST W.A. & HAY D. (1960). Haemadsorption and cytopathic effect produced by African swine fever virus in
swine bone marrow and buffy coat cultures. Am. J. Vet. Res.,
21, 104–108.
PAN I.C., TRAUTMAN R., HESS W.R., DE BOER C.J., TESSLER J., ORDAS A., SANCHEZ BOTIJA C., OVEJERO J. & SANCHEZ
M.C. (1974). African swine fever: comparison of four sero tests on porcine serums in Spain. Am. J. Vet. Res., 35,78790
PASTOR M.J., ARIAS M. & ESCRIBANO
J.M. (1990). Comparison of two antigens for use in an enzyme-linked immunosorbent assay to
detect
African swine fever antibody.
Am. J. Vet. Res.,51,
1540–1543.
PASTOR M.J., LAVIADA M.D., SANCHEZ VIZCAINO J.M. & ESCRIBANO J.M. (1989). Detection of African swine fever virus
antibodies by immunoblotting assay. Can. J. Vet. Res.,
53, 105–107.
SÁNCHEZ-VIZCAÍNO J.M. (1987). African swine fever diagnosis. In: African Swine Fever, Becker
Y., ed. Martinus Nijhoff, Boston, USA, 63–71.
SÁNCHEZ-VIZCAÍNO J.M. (2006). African swine fever. In: Diseases of Swine,Ninth Edition,Straw B.,D’Allaire S.,
Mengeling W., Taylor D., eds. Iowa State University,USA,
pp.
291–298.
SÁNCHEZ-VIZCAÍNO J.M., CROWTHER
J.R. & WARDLEY R.C. (1983). A collaborative study on the use of the ELISA in
the diagnosis of African
swine fever. In: African
Swine Fever. (CEC/FAO Research Seminar,
Sardinia, Sept.
1981). Wilkinson P.J., ed.
Commission of the European Communities Publication
EUR 8466 EN, 297–325.
SANCHEZ-VIZCAINOJ.M., MARTINEZ-LOPEZ B., MARTINEZ-AVILES M., MARTINS C., BOINAS B., VIAL L., MICHAUD V., JORI F.,
ETTER E., ALBINA E. & ROGER F. (2009). Scientific Review on African Swine Fever. CFP/EFSA/AHAW/2007/02, pp: 1–141.
VINUELA E. (1985). African swine
fever. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 116, 151–170.
WARDLEY R.C.,
ABU ELZEIN E.M.E., CROWTHER
J.R. & WILKINSON P.J. (1979).
A solid-phase
enzyme-linked
immunosorbent assay for
the detection of African swine fever antigen
and
antibody. J. Hyg.,
83,
363–369.
*** Oleh Drh Giyono Trisnadi, alih bahasa dari oie Terrestrial Manual dengan
judul: African Swine Fever.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar