Deskripsi
Penyakit: African Horse Sickness (AHS) adalah penyakit virus menular tetapi
tidak bersifat kontagius yang dapat menginfeksi semua spesies kuda /equidae
yang disebabkan oleh Orbivirus dari famili Reoviridae dan ditandai oleh
perubahan fungsi pernapasan dan peredaran darah. AHS ditularkan oleh setidaknya
dua spesies Culicoides. Sembilan serotipe yang berbeda telah dijelaskan.
Semua
serotipe AHS telah mewabah di Afrika timur dan selatan. AHS serotipe 9, 4 dan 2
telah ditemukan di Afrika Utara dan Barat dari mana mereka biasa menyebar ke
negara negara di sekitar Mediterania. Contoh wabah yang terjadi di luar Afrika
adalah: di Timur Tengah (1959-1963), di Spanyol (serotipe 9, 1966, serotipe 4,
1987-1990), dan di Portugal (serotipe 4,1989).
Diagnosis
laboratorium terhadap AHS adalah penting. Meskipun gejala klinis dan lesinya
bersifat karakteristik, namun bisa membingungkan dengan gejala penyakit kuda
lainnya.
Sebagaimana
penyakit virus, diagnosis laboratorium AHS dapat didasarkan pada identifikasi
virus infeksius, virus asam nukleat, antigen virus atau antibodi spesifik.
Selama beberapa tahun terakhir, berbagai tes laboratorium telah disesuaikan
untuk mendeteksi kedua virus AHS (AHSV) dan antibodi spesifik.
ldentification
Agen: Sangat penting untuk melakukan isolasi virus dan melakukan serotyping
setiap kali wabah terjadi di luar daerah enzootic untuk memilih serotipe
homolog untuk vaksin.
AHSV
dapat diisolasi dari darah yang dikumpulkan selama tahap awal demam. Untuk
isolasi virus, jaringan lain sebagai pilihan untuk diagnosis adalah limpa, paru-paru,
dan kelenjar getah bening, dikumpulkan saat nekropsi. Sampel yang dipreparasi
dapat diinokulasi dalam kultur sel, seperti baby hamster kidney-21 (BHK-21),
monkey stable (MS), African green monkey kidney (Vero) atau insect cells (KC),
intravena dalam telur berembrio, dan intracerebrally di tikus yang baru lahir.
Beberapa tes enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) untuk deteksi cepat
AHSV antigen dalam darah, jaringan limpa dan supernatan dari sel yang
terinfeksi telah dikembangkan. Identifikasi AHSV RNA juga telah dicapai dengan
menggunakan metode polymerase chain reaction reverse-transkripsi. Isolat virus
dapat diserotykan dengan tes serologi tipe-spesifik seperti virus netralisasi
(VN) dan dengan reverse-transcription polymerase chain reaction (RTPCR) dan
sequensing.
Tes
Serologi: Kuda yang bertahan karena infeksi alami mengembangkan antibodi
terhadap serotipe yang menginfeksi dari AHSV dalam waktu 8 -12 hari setelah
infeksi. Hal ini dapat dibuktikan oleh beberapa metode serologis, seperti
complement fixation test (CFT), ELISA, imunoblotting dan VN. Tes terakhir ini
digunakan untuk serotipe.
Persyaratan
untuk vaksin: Vaksin hidup yang dilemahkan (monovalen dan polivalen) digunakan
untuk kuda, bagal dan keledai, saat ini tersedia secara komersial. vaksin
subunit secara telah dievaluasi.
A.
PENDAHULUAN
African
horse sickness (AHS) (Peste equina africana, Peste equine) adalah penyakit
menular, non kontak arthopod-borne diseases dari Equidae, disebabkan oleh untai
ganda RNA Orbivirus familia Reoviridae. Genus Orbivirus juga termasuk
diantaranya penyakitt virus Bluetongue dan virus Epizootic hemoragik, yang
memiliki sifat yang mirip morfologi dan biokimianya dengan sifat patologis dan
sifat antigeniknya serta jumlah hospesnya. Sembilan serotipe antigen yang
berbeda dari AHSV telah diidentifikasi dengan neutralisasi virus; beberapa
reaksi silang telah diamati antara 1 dan 2, 3 dan 7, 5 dan 8, dan 6 dan 9, tapi
yang terjadi diketahui tidak ada reaksi silang dengan orbiviruses lainnya.
Virion
adalah partikel tak beramplop dengan ukuran sekitar 70 nm. Genom virus AHS
(AHSV) terdiri dari sepuluh segmen untai ganda RNA, yang mengkodekan tujuh
protein berstruktur (VP1-7), sebagian besar yang telah benar-benar disequencing
/diurutkan pada AHSV serotipe 4, 6 dan 9 (Roy et al., 1991; Venter et al,
2000;.. Williams et al, 1998) dan empat protein takberstruktur (NS1, NS2, NS3,
NS3A) (Grubman & Lewis, 1992;. Laviada et al, 1993). Protein VP2 dan VP5
membentuk kapsid luar virion, dan protein VP3 dan VP7 adalah protein kapsid
dalam utama. Protein VP1, VP4 dan VP6 merupakan protein kapsid dalam minor.
Protein NS3 adalah protein AHSV paling bervariabel kedua (Van Niekert et al.,
2001), Yang paling bervariabel menjadi protein kapsid luar utama, VP2. Protein
ini, VP2, adalah penentu serotipe AHSV dan, bersama-sama dengan VP5, target
untuk aktivitas netralisasi virus (Martinez-Torrecuadrada et al., 2001).
Setidaknya dua vektor lapangan yang terlibat dalam penularan virus: imicola
Culicoides dan C. bolitinos.
AHS
adalah enzootic di sub-Sahara Afrika, meskipun wabah sesekali terjadi di Afrika
utara (1965, 1989-1990), Timur Tengah (1959-1961), dan di Eropa (Spanyol, 1966,
1987-1990 dan Portugal, 1989) (Sanchez-Vizcaino, 2004).
Ada
empat bentu klinis klasik AHS: Paru, Jantung, Campuran, dan horse sickness
fever. Bentuk Paru, Perakut terjadi pada hewan yang sangat rentan dan
penularan yang cepat, sering hanya beberapa jam, dan tingkat kematian yang
tinggi. Hewan menunjukkan gangguan pernapasan, kepala dijulurkan dengan
lehernya, dan berkeringat banyak. Kesakitan parah, buih keluar dari lubang
hidung. Bentuk Jantung, edema subakut dengan angka kematian mencapai 50%.
Kepala dan leher mungkin terlihat membengkat parah yang dapat mencapai dada.
Pembengkakan fossae supraorbital adalah karakteristik dan mungkin disertai
kebengkakan dan petekie konjungtiva. Kelumpuhan kerongkongan dapat menyebabkan
pneumonia aspirasi dan pendarahan sublingual sebagai tanda prognosa yang buruk.
Bentuk Campuran, bersifat akut yang paling sering terlihat dan memiliki gejala
dari kedua bentuk gejala jantung dan bentuk paru. Mortalitas dapat mencapai
70%. Bentuk Horse sickness fever (demam kuda) sering diabaikan, gejala ringan
dari penyakit dan terlihat pada Equidae yang resisten seperti zebra dan keledai
(Coetzer & Guthrie, 2005).
Penyakit
ini terjadi dalam dua musim (akhir musim panas /musim gugur) dan siklus
kejadian epizootik di Afrika Selatan saat ketika fase hangat (Baylis et al.,
1999). Kematian akibat AHS berhubungan dengan spesies Equidae yang terkena dan
strain atau serotipe virus. Di antara Equidae, kuda yang paling rentan terhadap
AHS dengan angka kematian antara 50 - 95%, kemudian keledai dengan angka
kematian sekitar 50%. Di daerah enzootik Afrika, keledai sangat tahan terhadap
AHS dan dari pengalaman hanya terinfeksi subklinis. Di negara-negara Eropa dan
Asia, namun demikian, keledai cukup rentan dan memiliki tingkat kematian 10%.
Zebra ternyata tahan tanpa tanda tanda klinis, kecuali demam, dan mungkin
viremia yang lama (sampai 40 hari).
Diagnosis
laboratorium sangat penting untuk konfirmasi dan menegakkan diagnosa yang
benar. Meskipun beberapa tanda-tanda klinis dan lesi sangat karakteristik, AHS
dapat dibingungkan dengan penyakit lain. Misalnya, pembengkakan supraorbital,
yang sering terlihat pada kuda dengan subakut AHS, adalah, Ketika
dikombinasikan dengan sejarah yang tepat, cukup untuk diagnosis tentatif.
Tanda-tanda dan lesi lainnya kurang spesifik untuk AHS, dan penyakit lain
seperti equine encephalosis, equine infectious anaemia, equine morbillivirus
pneumonia, equine viral arteritis, babesiosis dan purpura haemorrhagica harus
dikecualikan (OIE Technical Disease Cards:
http://www.oie.int/en/animal-health-in- the-world/technical-disease-cards/).
Vaksin
hidup yang dilemahkan (monovalen dan polivalen) digunakan untuk kuda, bagal dan
keledai, saat ini tersedia secara komersial.
Tidak
ada bukti bahwa manusia dapat terinfeksi oleh strain lapangan virus AHS, baik
melalui kontak secara alami atau hewan percobaan yang terinfeksi atau dengan
manipulasi virus di laboratorium.
B.
TEKNIK DIAGNOSA
Beberapa
teknik sudah ada untuk identifikasi virus AHS mulai dari rapid capture
(indirect sandwich) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), menggunakan
polyclonal antibodies (PAbs) atau
monoclonal antibodies (MAbs), sampai dengan menggunakan tes polymerase chain
reaction (PCR), termasuk reverse-transcription (RT) PCR untuk diskriminasi dari
sembilan serotipe AHSV atau kultur sel dan inokulasi tikus yang baru lahir.
Jika memungkinkan lebih dari satu tes harus dilakukan untuk mendiagnosis wabah
AHS, terutama kasus utama. Tes awal bisa menjadi tes cepat seperti ELlSA atau
PCR, diikuti oleh isolasi virus dalam kultur jaringan. Netralisasi virus (VN)
untuk identifikasi serotipe atau RT-PCR dengan sequencing harus dilakukan
sebisanya di awal wabah sehingga serotipe dapat diidentifikasi dan vaksin yang
benar bisa dipilih.
Saat
ini, tidak ada standar internasional untuk virus atau reagen diagnosanya, dan
tidak ada metodologi standar untuk identifikasi virus AHS. Namun, virus dan
panel antibodi telah dinilai, dan studi komparatif berbeda antara ELISA untuk
antigen virus AHS dan antibodi determinasi telah dilakukan di laboratorium yang
berbeda, termasuk di Laboratorium Referensi Uni Eropa untuk AHS. Hasil telah
diperlihatkan korelasi tingkat tinggi untuk kedua antigen dan antibodi
determinasi dengan di tempat pengujian dan kit komersial (Rubio et al, 1998;.
Villalba, 2009). penelitian serupa telah dilakukan dengan beberapa tes RT-PCR
(Aquero, 2009) juga terlihat korelasi yang tinggi.
Aspek
yang sangat penting dari diagnosis adalah pemilihan sampel dan transportasi
sample ke laboratorium yang aman.
1.
Identifikasi terhadap agen penyakit
1.1.
Isolasi Virus
Darah
(whole blood) beku diambil ketika tahap demam awal penyakit dari hewan yang
sakit, serta potongan-potongan kecil (2-4 g) limpa, paru-paru dan kelenjar
getah bening dari hewan yang telah mati, adalah sampel pilihan untuk diagnosis.
Sampel harus disimpan pada suhu 4 ° C selama transportasi dan penyimpanan
jangka pendek sebelum diproses.
1.1.1.
Kultur Sel
Isolasi
langsung yang sukses terhadap virus AHS telah dilakukan pada ginjal bayi
hamster /baby hamster kidney (BHK-21), monyet /monkey stable (MS) dan ginjal
monyet hijau afrika /African green monkey kidney (Vero) sel line mammalia dan
pada Culicoides dan sel line serangga nyamuk. Sampel darah yang dikumpulkan
dalam antikoagulan yang tepat dapat digunakan tanpa diencerkan sebagai
inokulum. Setelah 15-60 menit dari adsorpsi pada suhu sekitar atau pada suhu 37
°C, kultur sel dicuci dan media pemeliharaan ditambahkan. Atau dan lebih umum,
darah dicuci, dilisiskan dan diencerkan 1/10. Prosedur ini menghilangkan
antibodi yang tidak diinginkan, yang bisa menetralisir virus bebas, dan
meningkatkan pelepasan virus yang terkait dengan membran sel darah merah.
Ketika sampel jaringan, seperti limpa, paru-paru, dll, yang digunakan, suspensi
jaringan 10% disiapkan dalam phosphate buffered saline (PBS) atau media kultur
sel, yang mengandung antibiotik.
Efek
sitopatik /cytopathic effect (CPE) mungkin
muncul antara 2 dan 10 hari pasca-infeksi dengan sel mamalia. Tiga kali pasase
harus dilakukan sebelum sampel bisa menjadi negatif. Tidak ada CPE teramati
dalam sel serangga namun keberadaan virus dapat dideteksi dalam supernatan
setelah 5-7 hari dengan real-time RT-PCR. Supernatan dari sel serangga yang
terinfeksi kemudian dapat diteruskan ke sel mamalia, yang akan menampilkan CPE
setelah satu atau dua pasase.
1.1.2.
Bayi Tikus (baby mice)
Metode
ini dari isolasi virus AHSV termasuk inokulasi intraserebral dari dua famili
tikus umur 1-3 hari. Dalam kasus positif, hewan memunculkan gejala gejala saraf
antara 3 dan 15 hari pasca inokulasi. Otak dari hewan yang sakit dapat
dikumpulkan, dihomogenasi dan kembali diinokulasi secara intracerebral menjadi setidaknya
enam tikus umur 1-3 hari. Bagian (pasase) kedua ini harus menunjukkan periode
singkat inkubasi (2-5 hari) dan mortalitas 100%. Virus dapat golongkan langsung
dari otak tikus dengan netralisasi konvensional (VN) atau dengan ekstraksi RNA
dan sequencing.
1.2.
Metode asam nukleat
1.2.1.
Reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)
Reverse-transcription
polymerase chain reaction (RT-PCR) adalah teknik yang sangat sensitif yang
memungkinkan deteksi jumlah yang sangat rendah dari salinan molekul RNA, tapi
ini tidak selalu menunjukkan adanya virus infeksius. Strand RNA adalah yang
pertama ditranskripsikan terbalik.
Dalam
DNA komplementer (cDNA), diikuti oleh amplifikasi yang dihasilkan DNA
menggunakan polymerase chain reaction. Teknik ini telah meningkatkan deteksi
AHSV-RNA dengan meningkatkan sensitivitas deteksi dan memperpendek waktu yang
dibutuhkan untuk diagnosis.
Beberapa
agarose gel-based RT-PCR assays untuk mendeteksi spesifik AHSV RNA telah
dijelaskan ditargetkan pada segmen viral 3, 7 atau 8 (Aradaib, 2009; Bremer et
al., 1998; Laviada et al., 1997; Sakamoto et al., 1994; Stone-Marschat et al.,
1994; Zientara et al., 1994). Metode
yang paling banyak digunakan menggunakan primer sesuai dengan ujung 5'
(nukleotida 1-21) dan ujung 3' (nukleotida 1160-1179) dari RNA segmen 7
menjelaskan segmen virus lengkap.
Metode
Real-time RT-PCR (RRT-PCR) untuk deteksi yang sangat sensitif dan spesifik
virus AHS RNA baru-baru ini telah dikembangkan berdasarkan penggunaan sepasang
primer dan probe TaqMan dari rangkaian virus segmen 5 atau 7 (Aguero et al.. 2008; Fernandez-Pinero et
al., 2009; Rodriguez-Sanchez et al., 2008).
Sebuah RRT-PCR duplex juga telah dijelaskan bahwa menargetkan segmen 8
dan 9 dari genom dan menggunakan Taqman® probe (Quan et al., 2010). Meskipun
kedua prosedur gel-based dan RRT-PCR dapat mendeteksi strain dari serotipe
sembilan virus, RRT-PCR memberikan keuntungan dibandingkan metode agarose
gel-based RT-PCR, dengan waktu analisis lebih cepat, sensitivitas yang lebih
tinggi, dan sesuai untuk otomatisasi yang tinggi. Namun demikian gel-based
RT-PCR, khususnya untuk memperkuat fragmen RNA panjang (Laviada et al, 1997;..
Zientara et al, 1994), dapat sangat berguna dalam karakterisasi genetik virus
lebih lanjut dengan sekuensing amplikon.
AHSV
agarose gel-based RT-PCR dan real-time RT-PCR secara rinci diberikan di bawah.
a) Ekstaksi RNA Virus
Untuk
menjamin reaksi yang baik perlu untuk mengekstrak dari sampel suatu AHSV RNA
berkualitas tinggi. Ekstraksi asam nukleat dari sampel klinis dapat dilakukan
dengan berbagai metode biasa (in-house) dan metode yang tersedia komersial.
Contoh
ekstraksi RNA biasa (in-house) diberikan di bawah ini:
i) 1
g sampel jaringan dihomogenasi dalam 1 ml larutan terdenaturasi (4 M guanidin
tiosianat, 25 mM natrium sitrat, 0,1 M 2-mercaptoethanol, 0,5% sarkosyl)....
ii) Setelah
sentrifugasi, 1 µg ragi RNA, 0,1 ml 2 M natrium asetat pH 4, 1 ml fenol dan 0,2
ml campuran kloroform /alkohol isoamil (49/1) ditambahkan ke supernatan.
iii)
Suspensi dikocok dengan kuat dan didinginkan di atas es selama 15 menit.
iv) Setelah
sentrifugasi, RNA dalam fase air adalah ekstraksi fenol, presipitasi etanol dan
diresuspensi dalam air steril.
Kit
komersial menggunakan pendekatan yang berbeda untuk isolasi RNA. Sebagian besar
didasarkan pada salah satu dari prosedur berikut:
a) Ekstraksi fenol-kloroform asam nukleat;
b) Adsorpsi asam nukleat pada sistem filter;
c) Adsorpsi asam nukleat pada sistem alat
magnetik.
1.2.2.
Prosedur agarose gel-base RT-PCR (Laviada et al., 1997; Zientara et al., 1994)
Denaturasi
dari ekstrak RNA harus dilakukan sebelum prosedur RT-PCR. Urutan dari primer
PCR yang digunakan adalah 5'-GTT-AAA-ATT-CGG-TTA-GGA-TG-3', yang sesuai dengan
polaritas messenger RNA, dan
5'-GTA-AGT-GTA-TTC-GGT-ATT-G-3', yang merupakan pelengkap untuk polaritas
messenger RNA. Semua komponen yang diperlukan untuk transkripsi terbalik dan
PCR termasuk dalam tabung reaksi yang mengandung RNA terdenaturasi. Langkah
satu RT-PCR dilakukan dengan menginkubasi di thermocycler sebagai berikut: 45
menit sampai 1 jam pada 37-55 °C, 5-10 menit pada 95 °C, kemudian 40 siklus:
94-95 °C untuk 1 menit, 55 °C selama 1-1,5 menit, 70-72 °C selama 2-2,5 menit,
diikuti dengan perpanjangan langkah terakhir dari 7-8 menit pada 70-72 °C. Analisis produk PCR dilakukan dengan
elektroforesis gel agarosa. Sampel AHS positif akan selesai dalam pasangan basa
band 1179 yang dapat digunakan sebagai template dalam reaksi sekuensing,
mengunakan primer PCR mandiri, untuk memperoleh Urutan nukleotida segmen 7
virus.
1.2.3.
Prosedur Real-Time RT-PCR (Aguero et al., 2008)
Kelompok-spesifik
real-time RT-PCR ini telah digunakan dengan hasil yang baik oleh laboratorium
rujukan nasional yang berpartisipasi dari anggota negara Uni Eropa (UE) dalam
uji kemampuan yang diselenggarakan oleh laboratorium rujukan Uni Eropa untuk
AHS (Aguero, 2009). RRT-PCR dilakukan sebagai berikut:
i) 2
µl dari isolat RNA dicampur dengan maju (5'-CCA-GTA-GGC-CAG-ATC-AAC-AG-3 ') dan
mundur (5'-CTA-ATG-AAA-GCG-GTG-ACC-GT- 3 ') primer (2,5 ml masing-masing primer
pada 8 µM) dan RNAse bebas air hingga 7 µl.
ii) Campuran
ini didenaturasi dengan pemanasan pada 95 °C selama 5 menit, diikuti dengan
pendinginan cepat di atas es.
iii)
Sintesis cDNA dan amplifikasi hot-start PCR dilakukan dalam satu langkah, dalam
volume 20 µl mengandung campuran RNA-primer terdenaturasi, 0,1 µl dari probe
fluorogenik MGB-TaqMan (5'-FAM-GCT-AGC-AGC -CTA-CCA-CTA-MGB-3', probe berlabel
5' dengan 6-carboxyfluorescein, FAM, dan 3' dengan non-fluorescent quencer
terikat ke grup MGB) dalam 50 µM (konsentrasi akhir: 0,25 M), penyangga yang
memadai dan enzim (RTase dan DNA polimerase pada konsentrasi yang
direkomendasikan oleh produsen).
iv) Kondisi
amplifikasi terdiri dari langkah pertama reverse-transkripsi pada 48 °C selama
25 menit, diikuti oleh 10 menit pada 95 °C ('mulai panas') dan 40 siklus 15 detik pada 95 °C, 35 detik
pada 55 °C dan 30 detik pada 72 °C (atau 40 siklus pada 97 °C selama 2 detik
dan 55 °C selama 30 detik jika reagen dan thermocycler memungkinkan reaksi
cepat yang digunakan). Data fluoresensi diperoleh pada 55 °C akhir langkah.
v) Sampel
dianggap positif jika fluoresensi naik signifikan di atas level dasar. Jika
tidak ada fluoresensi terdeteksi selama seluruh real-time RT-PCR, sampel
dianggap negatif.
Virus
yang dilemahkan serotipe 1-9 strain referensi dapat diperoleh dari Laboratorium
Referensi OIE di Spanyol untuk mensetup metode deteksi RT-PCR.
1.3.
Virus AHS (AHSV)
Sampai
saat ini, tes VN telah menjadi metode pilihan untuk menentukan tipe serta uji
standar 'emas' untuk mengidentifikasi virus AHS yang diisolasi dari lapangan
dengan menggunakan antisera tipe-spesifik (Verwoerd, 1979). Teknik ini
membutuhkan waktu 5 hari atau lebih sebelum hasil yang diperoleh. Pengembangan
tipe spesifik gel-based RT-PCR (Sailleau et al., 2000), dan real-time RT-PCR
menggunakan hybridisasi probes (Koekemoer,2008) untuk identifikasi dan
diferensiasi genotipe AHSV, ada metode menentukan tipe secara cepat untuk AHSV
dalam sampel jaringan dan darah. Ada korelasi yang baik antara hasil yang
diperoleh dengan tipe tertentu RT-PCR dan tes VN, bagaimanapun, sensitivitas
tes ini lebih rendah dari pada yang diperoleh dengan diagnostik kelompok
tertentu real-time RT-PCR (Aguero et
al., 2008). tipe spesifik tes rRT-PCR berdasarkan penggunaan probe TaqMan-MGB
telah dikembangkan baru-baru ini (Tena, 2009) dan memiliki kepekaan yang sama
dengan kelompok-spesifik rRT-PCR. Namun, variasi genetik yang mungkin muncul
dari waktu ke waktu dalam genom AHSV, khususnya di VP2 kode daerah, di mana
primer spesifik /probe untuk penentuan tipe harus dirancang, membuat deteksi
semua varian genetik dalam setiap serotipe oleh jenis teknik yang sulit
(Koekemoer, 2008). Oleh karena itu, meskipun metode molekuler dapat dengan
cepat mentipekan AHSV di banyak sampel lapangan yang positif, VN harus disimpan
sebagai standar emas untuk serotipe isolate AHSV.
Penentuan
tipe dari sembilan jenis AHSV juga telah dilakukan dengan probe dikembangkan
dari satu set gen full-length kloning VP2 (Koekemoer et al., 2000). Teknik ini
dapat digunakan sebagai alternatif untuk PCR amplifikasi genom segmen 2.
2.
Tes Serologis
Teknik
indirect dan blok kompetitif ELISA menggunakan larutan antigen AHSV atau
protein rekombinan VP7 (Hamblin et al, 1990;. Laviada et al, 1992b;. Maree
& Paweska, 2005) telah terbukti menjadi metode yang baik untuk mendeteksi
anti-AHSV kelompok antibodi -reactive, terutama untuk investigasi skala besar
(Rubio et al., 1998). Kedua tes ini telah diakui oleh Komisi Eropa (2002).
Teknik blok kompetitif ELISA juga dapat digunakan untuk menguji satwa liar
sebagai spesies-spesifik anti-globulin adalah tidak diperlukan dengan metode
ini. Tes immunoblotting juga telah diadaptasi untuk penentuan antibodi anti-AHS
(Laviada et al., 1992b), which is especially suitable for small numbers of
sera. The complement fixation (CF) test has been widely used, but some sera are
anti-complementary, particularly donkey and zebra sera. yang sangat cocok untuk
sejumlah kecil sera. Complement Fixation (CF) tes telah banyak digunakan,
tetapi beberapa sera adalah anti-complementer, terutama sera keledai dan zebra.
2.1.
Bloking Enzyme-linked immunosorbent Asssay (Tes diresepkan untuk perdagangan
internasional)
Teknik
blok kompetitif ELISA bertujuan mendeteksi antibodi spesifik terhadap HSV,
untuk setiap spesies kuda. VP7 adalah protein antigenik utama dalam struktur
molekul AHSV dan itu dilestarikan di sembilan serotipe AHSV. MAb diarahkan
terhadap VP7 digunakan dalam tes ini, memungkinkan sensitivitas dan
spesifisitas tinggi. Selain itu, spesies lain selain kuda (seperti keledai,
zebra, dll) dapat diuji sehingga mencegah masalah kekhususan yg dialami
sesekali pada penggunaan indirect ELISAs. VP7 antigen rekombinan adalah
non-reaktif, yang menyediakan tingkat keamanan yang tinggi (European
Commission, 2002).
Prinsip
dari tes ini adalah untuk memblokir reaksi spesifik antara rekombinan VP7
protein diserap di plate ELISA dan MAb terkonjugasi terhadap VP7 antibodi AHSV
dalam sampel serum tersangka akan memblokir reaksi ini. Penurunan jumlah warna
merupakan bukti adanya antibodi AHSV dalam sampel serum.
2.1.1.
Prosedur Pengujian (Tes)
i) Fase
padat: plate coat ELISA (misalnya kapasitas adsorpsi tinggi Nunc Maxisorb)
dengan 50-100 ng rekombinan AHSV-4 VP7 diencerkan dalam carbonate /bicarbonate
buffer, pH 9,6. Inkubasikan semalam pada suhu 4 ° C.
ii) Cuci
plate tiga kali dengan PBS 0,1x yang
mengandung 0,135 M NaCl dan 0,05% (v/v) Tween 20 (larutan pencuci). Tekan
dengan lembut plate ke bahan penyerap untuk menghilangkan residu cucian.
iii)
Uji sampel: sampel serum untuk diuji, dan positif dan serum control negatif
(jika tidak siap gunakan kit dari produsen), diencerkan 1/5 di pengencer
mengandung 0,35 M NaCl, 0,05% Tween 20; dan 0,1% Kathon, 100 ml per sumur
(well). Inkubasikan selama 1 jam pada 37 °C.
iv) Cuci
plate lima kali dengan PBS 0,1x yang mengandung 0,135 M NaCl dan 0,05% (v/v)
Tween 20 (larutan pencuci). Tekan dengan lembut plate ke bahan penyerap untuk
menghilangkan residu cucian.
v) Konjugat:
keluarkan 100 ml /well horseradish peroxidise-terkonjugasi MAb anti-VP7. MAb
ini harus diencerkan sebelumnya 1/5000 - 1/15000 dalam 1/1 larutan StabiliZyme
Select® Stabilizer (SurModics Referensi: SZ03) dalam air suling. Inkubasikan
selama 30 menit pada suhu 37 °C.
vi) Cuci
plate seperti yang diuraikan pada langkah iv.
vii)
Substrat /chromogen: tambahkan 100 µl/well 1/10 diencerkan pada larutan
substrat ABTS, 5 mg/ml substrate buffer
(0.1 M
phosphate/citrate buffer pH 4,
yang mengandung 0,03% H202) dan inkubasikan selama 10 menit pada suhu kamar.
perkembangan warna dihentikan dengan menambahkan 100 µl/well 2% (w/v) SDS.
viii)
Baca plate pata 405 nm.
ix) Interpretasi
hasil: menentukan persentase blocking (BP) dari masing-masing sampel dengan
memakai rumus berikut:
Abs
(control-) – Abs (sampel)
BP = x
100
Abs
(control-) – Abs (control+)
Sampel
menunjukkan nilai BP lebih rendah dari 45% dianggap negatif untuk antibodi
terhadap AHSV. Sampel menunjukkan nilai BP yang lebih tinggi dari 50% dianggap
positif untuk antibodi untuk AHSV. Sampel dengan nilai BP antara 45% dan 50%
dianggap diragukan dan harus diuji ulang. Jika hasilnya adalah sama, resample
dan uji 2 minggu kemudian.
2.2.
Inderect enzyme-linked immunosorbent assay (uji yang diresepkan untuk
perdganagn internasional)
Protein
VP7 rekombinan telah digunakan sebagai antigen untuk penentuan antibodi AHSV
dengan tingkat sensitivitas dan spesifisitas tinggi (Laviada et al., 1992b;
Wade-Evans et al., 1993). Keuntungan lain dari antigen ini adalah stabilitas
dan kurangnya infektivitas. Konjugat yang digunakan dalam metode ini adalah
horseradish peroksidase anti-kuda gamma-globulin bereaksi dengan kuda, bagal
dan keledai. Metode ini dijelaskan oleh Maree & Paweska (2005) menggunakan
protein G sebagai konjugat yang juga bereaksi dengan serum zebra.
2.2.1.
Prosedur Pengujian
i) Fase
padat: piring coat ELISA (misalnya kapasitas adsorpsi tinggi Nunc Maxisorp)
dengan rekombinan HSV-4 VP7 diencerkan dalam karbonat /penyangga bikarbonat, pH
9,6. Inkbasikan semalam pada 4 °C.
ii) Cuci
plate lima kali dengan air suling yang mengandung 0,01% (v/v) Tween 20 (larutan
pencuci). Tekan dengan lembut plate ke
bahan penyerap untuk menghilangkan residu cucian.
iii)
Plate di blok dengan PBS, pH 7.2 + 5% (w/v) susu skim, 200 µl/well, selama 1
jam pada suhu 37 °C.
iv)
Buang larutan pemblok dan tekan dengan lembut plate ke bahan penyerap.
v) Pengujian
sampel: Sampel serum yang akan di uji, dan serum control positip dan negatip,
diencerkan dalam 1/25 PBS + susu skim 5% (w/v) + Tween 0.05% (v/v), 100 µl per
well. Inkubasikan selama 1 jam pada susu 37 °C. Untuk Titrasi, tambahkan
pengenceran dua kali lipat dari 1/25 (100 µl/well), satu serum setiap kolom
plate, dan kerjakan dengan cara yang sama untuk control posistip dan
negatipnya.
vi) Cuci
plate seperti yang dijelaskan pada langkah ii.
vii)
Konjugat: keluarkan 100 ml /well dari horseradish peroxidase terkonjugasi
anti-horse gamma- globulin encerkan dalam PBS + 5% susu + 0,05% Tween 20, pH
7,2 Inkubasikan selama 1 jam pada 37 °C atau protein A peroksidase (Maree &
Paweska, 2005).
viii)
Cuci plate plate seperti yang dijelaskan pada langkah ii
ix) Substrat:
Tambahkan 200 µl/well larutan substrat (10 ml DMAB + 10 ml MBTH + 5 ml H202).
perkembangan Warna dihentikan dengan menambahkan 50 µl 3 N H2S04 setelah
approximately menit 5-10 menit (sebelum kontrol negatif mulai berwarna).
Substrat lain seperti ABTS (2,2'-azino-di-[3-ethyl-benzothiazoline]-6-sulphonic
acid),, TMB (tetramethyl benzidine), atau 0PD (orthophenyldiamine) juga dapat digunakan.
x) Baca
plate plate pada 600 nm (or 620 nm).
xi) Interpretasi
hasil: Hitung nilai cut-off dengan menambahkan 0,6 dengan nilai kontrol
negatif. (0.06 adalah standar deviasi berasal dengan sekelompok 30 negatif
sera) sampel Uji memberikan absorbansia nilai lebih rendah dari cut-off
dianggap sebagai negatif. Sampel uji memberikan absorbansia nilai lebih besar
dari cut-off + 0,15 dianggap sebagai positif. sampel uji memberikan nilai
absorbansia menengah yang diragukan maka teknik kedua harus digunakan untuk
mengkonfirmasi hasilnya.
2.3.
Complement Fixation (resep uji untuk
perdagangan internasional)
Tes
CF telah digunakan secara luas di masa lalu, namun saat ini penggunaannya
menurun dan telah digantikan di banyak laboratorium dengan ELISA sebagai teknik
skrining. Penggantian secara progresif ini adalah karena sensitivitas yang
lebih tinggi dan tingkat standarisasi ELISA serta sejumlah besar sera dengan
aktivitas anticomplementer. Namun demikian tes CF adalah alat yang berguna di
daerah endemik untuk demonstrasi dan titrasi kelompok-spesifik IgM antibodi
terhadap AHSV terutama setelah infeksi baru atau vaksinasi.
2.3.1.
Reagen
i) Veronal buffer saline yang mengandung 1%
gelatin (VBSG).
ii) Serum
samples, free from erythrocytes, must be heat inactivated: horse serum at 56°C,
zebra serum at 60°C and donkey serum at 62°C, for 30 minutes. Sampel serum,
bebas dari eritrosit, harus panas tidak aktif: serum kuda pada 56 °C, serum
zebra pada 60 °C dan serum keledai pada 62 °C, selama 30 menit.
iii)
Antigen adalah sukrosa / aseton ekstrak otak tikus yang terinfeksi HCV. Antigen
kontrol yang tidak terinfeksi otak tikus, diekstraksi dengan cara yang sama.
Dengan tidak adanya sebuah serum standar internasional, antigen harus dititrasi
disiapkan secara lokal terhadap serum kontrol positif. Dalam tes, empat sampai
delapan unit yang digunakan. antigen juga dapat diperoleh dengan inokulasi
virus pada kultur sel yang cocok (lihat Bagian B.1 di atas).
iv) Komplemen
adalah serum hamster normal
v) Hemolisin
adalah serum kelinci hyperimmune terhadap domba sel darah merah (sel darah
merah).
vi) SRBCs
diperoleh dengan tusukan aseptik dari vena jugularis dan diawetkan di larutan
Alsever (1) atau natrium sitrat.
vii)
Sistem hemolitik (HS) yang dibuat dengan mengencerkan hemolisin yang mengandung
dua dosis hemolitik dan menggunakan ini untuk pencucian sensitive SRBCs. SRBCs
terstaandar pada konsentrasi 3%.
viii)
Serum kontrol: Serum kontrol positif diperoleh secara lokal dan divalidasi.
Serum dari kuda antibodi-negatif yang sehat digunakan sebagai serum kontrol
negatif.
_____________
(1) 20,5 g dekstrosa (114 mM), 7,9 g natrium
sitrat 2H20 (27 mM), 4,2 g NaCl (71 mM), H2O untuk 1 liter. Sesuaikan dengan pH
dengan 1 M asam sitrat
2.3.2.
Prosedur Uji
i) Reaksi
dilakukan dalam 96 well di dasar plate mikrotiter pada volume akhir 100 µl/well
atau dalam tabung jika makro-teknik yang digunakan, pada 4 °C selama 18 jam.
ii) Semua
sera, sampel dan kontrol diencerkan 1/5 di VBSG dan 25 µl setiap serum
ditambahkan dalam duplikatnya. Serangkaian pengenceran ganda masing-masing
serum dilakukan dari 1/5 ke 1/180.
iii)
Tambahkan 25 µl antigen encerkan menurut titrasi sebelumnya.
iv) Tambahkan
25 µl komplemen encerkan sesuai dengan titrasi sebelumnya.
v) Inkubasikan pada suhu 4°C selama 18 jam.
vi) Tambahkan
HS 25 25 µl pada semua well pada micrp plate.
vii)
Plate inkubasikan pasa suhu 37 °C selama 30 menit.
viii)
Pelat kemudian disentrifugasi pada 200 g, dan well mencatatan kehadiran
hemolisis. Sera kontrol, komplemen, antigen dan HS yang digunakan
ix) Hasil
dibaca menggunakan 50% hemolisis sebagai titik akhir. Kebalikan dari
pengenceran tertinggi serum khusus cocokan komplemen dengan antigen CF disebut
titer.
x) Titer
1/10 atau lebih adalah positif, di bawah 1/10 negatif.
2.4.
Virus Netralisasi (VN)
Antibodi
serotipe spesifik dapat dideteksi menggunakan tes VN (house dkk., 1990) tes VN
seharusnya sebagai nilai tambah dalam surveillance epedemiologi dan studi
penularan, di dareah endemik ada banyak serotipe yang didapatkan.
2.4.1.
Prosedur uji VN
i) Stok
virus diencerkan untuk menghasilkan 100 TCID50 (50% dosis infektif kultur
jaringan), dalam kisaran 30-300 TCID50, per 25 µl, dan 25 µl ditambahkan ke
masing-masing empat microtiter well mengandung 25 µl pengenceran serum. Untuk
screening, pengenceran serum akhir digunakan 1/10. Penggandaan pengenceran
digunakan untuk titrasi.
ii) Campuran
serum /virus yang diinkubasi selama 60 menit pada suhu 37 °C 5% C02 dan 95%
kelembaban sebelum penambahan 0,1 ml suspensi sel Vero (200.000 sel /ml) untuk
setiap well tes.
iii)
Titrasi kembali stok virus yang dipersiapkan untuk setiap tes menggunakan empat
well per sepuluh kali lipat pengenceran, 25 µl per well. Plate uji diinkubasi
pada 37 °C, 5% C02, kelembaban 95% selama 4-5 hari, sampai titrasi kembali
menunjukkan bahwa stok virus mengandung 30-300 TCID50.
iv) Plate
kemudian difiksasi dan warnai dalam larutan 0,15% (w/v) Kristal violet dalam 2%
(v/v) glutaraldehyde dan dibilas. Atau, mereka dapat difiksasi dengan 70 %
etanol dan diwarnai dengan 1% basic fuschsin.
v) 50%
titer end-point serum dihitung dengan metode Spearman-Karber dan dinyatakan
sebagai negatif log10.
C.
PERSYARATAN UNTUK VAKSINASI
1.
Latar belakang
1.1.
Alasan dan tujuan penggunaan produk
Vaksin
AHS hidup Polivalen atau monovalen yang dilemahkan, berdasarkan seleksi dalam
kultur sel Vero dari macroplaques genetik yang stabil, telah digunakan untuk
kontrol AHSV yang masuk dan keluar dari Afrika (Erasmus, 1976;
Sanchez-Vizcaino, 2004). vaksin polivalen tersedia secara komersial.
Vaksin
AHSV inaktif monovalen (serotipe 4) berdasarkan pemurnian virus dan inaktivasi
dengan formalin diproduksi secara komersial di awal 1990-an (Rumah et al.,
1992), tetapi tidak tersedia pada saat ini. Vaksin subunit AHSV berdasarkan
serotipe 4 luar VP2 protein kapsid dan VP5 ditambah dalam VP7 protein kapsid,
yang berasal dari rekombinan vektor tunggal dan ganda baculovirus telah
digunakan secara eksperimental dalam kombinasi yang berbeda untuk mengimunisasi
kuda (Martinez et al., 1996). Khasiat pelindung dari VP2 di subunit vaksin juga
dievaluasi (Scanlan dkk., 2002). Namun, vaksin ini tidak tersedia secara
komersial.
2.
Garis besar produksi dan persyaratan minimum untuk vaksin konvensional
At
present only the live attenuated AHS vaccines (polyvalent or monovalent) are
commercially available. Guidelines for the production of veterinary vaccines
are given
in
Chapter 1.1.8 Principles of veterinary vaccine production. Saat ini hanya
vaksin AHS hidup yang dilemahkan (polivalen atau monovalen) yang tersedia
secara komersial. Pedoman untuk produksi vaksin hewan diberikan dalam Bab 1.1.8
Principles of veterinary vaccine production. Pedoman yang diberikan di sini dan
dalam pasal 1.1.8 dimaksudkan untuk yang bersifat umum dan dapat dilaksanakan
sebagai persyaratan nasional dan regional.
3.
vaksin African Horse Sicknes Hidup Yang Dilemahkan
3.1.
Karakteristik Virus (Seed)
3.1.1.
Karakteristik Biologi
Virus
benih disiapkan dengan seleksi dalam sel Vero dari stebel plak besar secara
genetik dari pasase tingkat rendah dari virus AHS.
3.1.2.
Kriteria kualitas
Mutan
plak kemudian dikalikan dengan tiga bagian dalam sel Vero. Sebuah jumlah besar
antigen ini lipolisis dan disimpan pada -20 °C sebagai antigen benih. Virus benih
harus ditunjukkan menjadi bebas dari kontaminasi virus, bakteri dan mycoplasma
dengan teknik yang tepat. Identitas serotipe virus benih dikonfirmasi.
3.2.
Metode pabrikan
3.2.1.
Prosedur
Pada
awal produksi, antigen bekerja diproduksi dari antigen benih baik BHK-21 atau
kultur sel Vero. Antigen bekerja diuji sterilitasnya, kemurnian dan identitas
dan harus berisi minimal 1 x 106 unit form plak (plaque-forming units /PFU) /ml
virus infeksius.
3.2.2.
Persyaratan substrat dan media
Botol
Roller kultur dari Vero atau sel BHK-21 yang tumbuh menggunakan serum bovine
gamma-iradiasi dalam medium pertumbuhan. Ketika kultur ketemu, media dituangkan
dan sel-sel yang seeding dengan antigen yang bekerja. Setelah 1 jam, media
pemeliharaan ditambahkan ke kultur. Inkubasi dilanjutkan pada 37 °C selama 2-3
hari. Ketika CPE matang, baik sel dan menengah supernatan dipanen. Produk dari
serotip yang sama dikumpulkan dan disimpan pada suhu 4 °C.
3.2.3. Poses kontrol
Panen
yang dikumpulkan dari serotipe individu diuji sterilitas dan infektivitasnya
dengan plak titrasi pada kultur sel Vero. Titer minimum diterima adalah 1 x 106
PFU/ml.
Pada
akhirnya, dua vaksin quadrivalent yang dibentuk dengan mencampur volume yang
sama dari serotipe 1, 3, 4, 5 dan 2, 6, 7, 8 berurutan. Selanjutnya, AHSV
serotipe 5 ditarik dari vaksin ini. Jenis monovalen juga dapat disiapkan.
Setelah penambahan stabilizer yang cocok, vaksin di distribusikani dalam volume
1,0 ml ke vvial kaca dan beku-kering.
3.2.4.
Tes batch akhir produksi
i) Sterilitas
Setelah
lipolisasi, lima botol vaksin yang dipilih secara acak dan diuji sterilitasnya
dengan metode yang diterima secara internasional. Uji produk biologi untuk
sterilitas dan bebas kontaminasi diberikan dalam bab 1.1.9.
ii) Keamanan
Keamanan
vaksin ditentukan dengan inokulasi vaksin ke tikus (0,25 ml intraperitoneal),
hamster (1.0 ml intraperitoneal), dan kuda (5.0 ml subkutan). Semua binatang
diamati setiap hari selama 14 hari. Suhu rektal kuda diambil dua kali sehari
selama 14 hari dan tidak boleh melebihi 39 °C.
iii)
Batch Potensi batch
Potensi
sebagian besar berdasarkan pada konsentrasi virus dalam vaksin.
Dosis
minimum imunisasi untuk setiap serotipe sekitar 1 x 103 PFU/dosis. Infektivitas
titer produk akhir diuji dengan titrasi plak pada kultur sel Vero dan harus
berisi minimal 1 x 105 PFU/dosis. Kuda yang digunakan untuk pengujian keamanan
juga digunakan untuk menentukan imunogenisitas vaksin.
Sampel
serum dikumpulkan pada hari saat vaksinasi dan 21 hari kemudian, dan diuji
untuk netralisasi antibodi terhadap masing-masing serotipe dengan uji
plak-reduksi menggunakan pengenceran serum dua kali lipat dan sekitar 100 PFU
virus. kuda harus mengembangkan titer netralisasi antibodi minimal 20 melawan
setidaknya tiga dari empat serotipe dalam vaksin quadrivalent.
3.3
Persyaratan untuk otorisasi
Tidak
ada pedoman tertentu yang dijelaskan untuk vaksin AHS. Namun pedoman dijelaskan
di Uni Eropa untuk virus Bluetongue dalam keadaan luar biasa yang mungkin bisa
digunakan untuk virus AHS. Pedoman ini mencakup persyaratan tanggal minimum
untuk otorisasi di dalam keadaan luar biasa untuk produksi vaksin untuk
penggunaan darurat terhadap virus bluetongue (Peraturan EC N ° 726/2004,
khususnya Pasal 38, 39 dan 43 dari padanya dan Pasal 26 dari Direction
2001/82/EC), termasuk langkah-langkah petunjuk untuk memfasilitasi cepat
masuknya serotipe virus baru atau berbeda.
3. Vaksin berdasakan pada bioteknologi
3.1.
Vaksin yang tersedia dan mafaatnya
None
is available commercially. Experimental subunit vaccines have been described
Tidak ada vaksin yang tersedia dipasaran. Sub unit vaksin percobaan telah
diterangkan (Section C.1.1Rationale and intended use of the product).
3.2.
Persayratan khusus untuk vaksin bioteknologi jika ada
Tidak
ada.
******
Oleh: drh Giyono Trisnadi,
Disadur
dari AFRICAN HORSE SICKNES, by OIE, CHAPTER 2.5.1., SECTION 2.5. EQUIDAE. OIE
Terrestrial Manual 2017. NB: Version adopted by the Assembly of Delegates od
The OIE in May 2012.
******